食源性多酚對α-淀粉酶作用大米淀粉活性的影響

王 露, 黃立新, 劉 磊

(華南理工大學食品科學與工程學院1,廣州 510640) (五邑大學生物科技與大健康學院2,江門 529020)

糖尿病是一種以持續性高血糖水平和代謝功能紊亂為主要特征的慢性代謝疾病[1,2]。研究表明,患者的高血糖會增加糖尿病并發癥的發生率,如果在糖尿病早期能夠充分控制血糖水平,可以有效降低引發糖尿病并發癥的風險[3]。

調控人體糖代謝的關鍵之一在于調控淀粉酶的活性[4,5]。目前,主流的糖尿病治療主要為阿卡波糖等藥物,但是長期服用這類藥物容易引起腹脹、嘔吐等不良反應,甚至會對人體的肝腎造成一定的損害[6]。因此,尋找新型的天然、副作用少的糖尿病抑制劑變得十分重要。食源性多酚作為一類天然淀粉酶抑制劑,普遍存在于果蔬等天然食物中,在對糖尿病的防治方面具有巨大潛力。膳食多酚能夠通過調節消化酶活性的方式對糖尿病起到明顯的調節和改善作用[7-10]。茶多酚、丹寧等多酚已被證實能夠對消化過程中的關鍵酶(α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶)起到一定的抑制作用,使得淀粉中LDS、RS的含量增加。多酚對淀粉酶的抑制作用很大程度上取決于多酚結構。不同多酚與淀粉酶的相互作用不同,抑制機理也不同。對于黃酮類多酚而言,羥基位置和數量是抑制活性的重要決定因素,多酚結構的羥基化也會導致抑制作用的強弱發生變化[11,12]。同時,也有大量研究報道茶多酚能通過與酶的氫鍵及疏水相互作用,造成酶結構的破壞從而對α-淀粉酶產生抑制作用[5,13,14]。前期實驗已經發現食源性多酚阿魏酸、沒食子酸和槲皮素能通過氫鍵與大米淀粉發生相互作用并影響其消化性能[15],且在高濃度多酚條件下,多酚會影響α-淀粉酶的活性從而也會導致淀粉水解率的下降,而關于3種食源性多酚在大米淀粉為底物的條件下如何影響淀粉酶的活性還有待深入研究。

研究以大米淀粉為底物,通過建立3 mL抑制動力學體系以及繪制相關方程圖,探究食源性多酚阿魏酸、沒食子酸、蘆丁在37 ℃下對α-淀粉酶的抑制效果和抑制類型,確定相關抑制常數,為研究開發食源性多酚作為α-淀粉酶抑制劑并應用于糖尿病患者飲食提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬胰α-淀粉酶(10 U/mg),USP級;阿魏酸、沒食子酸、蘆丁、大米淀粉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、3,5-二硝基水楊酸、苯酚、酒石酸鉀鈉、無水葡萄糖,試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

PXSJ-226型離子計,722N可見光分光光度計,SHA-B水浴恒溫振蕩器,TDL-5-A臺式離心機。

1.3 方法

1.3.1 DNS法測定葡萄糖質量濃度

根據韓雪琴[16]的方法進行改進。將所配制的1 mg/mL葡萄糖標準溶液稀釋成0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mg/mL葡萄糖標準溶液,分別吸取0.5 mL稀釋后的葡萄糖標準溶液于10 mL試管中,加入0.5 mL DNS試劑,振蕩混勻,沸水浴5 min,冷卻至室溫,最后加入5.25 mL蒸餾水,混勻。用空白管調零,在540nm處測得吸光值(Abs),重復3次實驗,取平均值。以葡萄糖濃度為橫坐標,吸光值為縱坐標,繪制葡萄糖標準曲線。實驗測得葡萄糖標準曲線方程為y=0.869 8x-0.000 5,R2=0.999 1,線性關系良好,可用于確定樣液中葡萄糖質量濃度。

1.3.2 最適酶量的確定

分別吸取0.2 U/mL酶液0、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL于試管中,用pH 6.8磷酸鹽緩沖溶液補充至2 mL,混合均勻后置于37 ℃水浴中預熱20 min,添加1 mL預熱到37 ℃的質量濃度為30 mg/mL的大米淀粉溶液,置于37 ℃水浴中酶解3 min后,沸水浴10 min立即終止反應。反應終止后在5 000r/min條件下離心15 min,分別吸取0.5 mL上清液并用DNS法進行測定,以加入酶體積(μL)為橫坐標,吸光值(Abs)為縱坐標,繪制曲線。

1.3.3 食源性多酚對α-淀粉酶的抑制作用

分別吸取質量濃度為20 mg/mL的阿魏酸、沒食子酸多酚溶液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL于試管中,用pH 6.8磷酸鹽緩沖溶液補充至2.0 mL,得到濃度梯度為4、8、12、16、20 mg/mL的阿魏酸、沒食子酸多酚溶液;吸取質量濃度為8 mg/mL的蘆丁多酚溶液1.250、1.375、1.500、1.625、1.750 mL于試管中,用pH 6.8磷酸鹽緩沖溶液補充至2 mL,得到質量濃度梯度為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0 mg/mL的蘆丁多酚溶液。吸取0.5 mL酶液于試管中,分別加入1.5 mL不同質量濃度的阿魏酸、沒食子酸、蘆丁多酚溶液,混合均勻后置于37 ℃水浴中預熱20 min,添加1 mL預熱到37 ℃的大米淀粉溶液,置于37 ℃水浴中酶解3 min后,沸水浴10 min立即終止反應。反應終止后在5 000 r/min條件下離心15 min,分別吸取0.5 mL上清液并用DNS法進行測定利用式(1)計算食源性多酚對α-淀粉酶活性的抑制率。以食源性多酚質量濃度作為橫坐標(mg/mL),抑制率為縱坐標,進行多元非線性擬合,繪制抑制曲線,利用回歸方程求得半抑制濃度IC50。α-淀粉酶活性抑制率的計算公式為:

(1)

式中:A1為對照組吸光值;A2為對照空白組吸光值(等量緩沖液代替酶液);A3為樣品組吸光值;A4為樣品空白組吸光值(等量緩沖液代替酶液)。

1.3.4 食源性多酚對α-淀粉酶抑制類型的研究

1.3.4.1 抑制類型的研究

參照1.3.3中的方法,配制0.16、0.20、0.40、0.53、0.80 U/mL的酶液和質量濃度為6 mg/mL的阿魏酸、沒食子酸、蘆丁多酚多酚溶液,測定大米淀粉在不同酶濃度溶液下反應的吸光值。以酶液質量濃度(mg/mL)作為橫坐標,以酶反應初速率[mg/(mL·min)]作為縱坐標,繪制抑制曲線。

1.3.4.2 測定及計算α-淀粉酶的米氏常數

配制質量濃度為14、20、30、50、70 mg/mL的大米淀粉溶液,參照1.3.3方法測定在無抑制劑的條件下,不同底物濃度下反應的酶促反應初速率。以反應物濃度的倒數1/[S]作為橫坐標,以反應速率的倒數1/V作為縱坐標,繪制Lineweaver-Burk雙倒數曲線,計算α-淀粉酶的米氏常數Km及最大反應速率Vmax。

1.3.4.3 食源性多酚對α-淀粉酶的抑制動力學實驗

將阿魏酸、沒食子酸配制成質量濃度為6、9、12 mg/mL的多酚溶液,蘆丁配制成質量濃度為4、5、6 mg/mL的多酚溶液,參照1.3.4.2中的方法進行酶解反應,計算在不同多酚濃度條件下,不同底物濃度反應的酶促反應初速率,繪制并分析Lineweaver-Burk雙倒數曲線圖、Dixon曲線圖和Cornish-Bowden曲線圖,確定3種食源性多酚對α-淀粉酶的抑制類型以及相關動力學參數。

1.4 數據統計及分析

每組實驗重復進行3次測定,采用 IBM SPSS Statistics 26.0 軟件對數據進行整理及統計分析,實驗數據使用Origin 9.0軟件進行制圖。

2 結果與分析

2.1 確定最適酶量

根據中間絡合物假說[17],當底物(S)處于過量狀態,酶首先和底物結合生成復合物,此時溶液中的酶全部被底物飽和,即反應達到最大反應速率(Vmax)且此時反應速度保持恒定不變[18],這一時期稱為零級反應期。建立酶動力學方程的關鍵在于建立零級反應。加入酶體積與生成葡萄糖濃度的關系為y=4.860 4-0.04,R2=0.993 5,具有良好的線性關系。根據標準曲線方程可求得不同酶液加入量所對應生成的葡萄糖質量濃度。當葡萄糖質量濃度在0.1～0.8 mg/mL時,吸光度具有良好的線性關系。考慮到要使酶液能夠被過量底物完全飽和,并且確保實驗反應所生成的葡萄糖含量在0.1～0.8 mg/mL之間,因此確定研究中抑制動力學實驗的酶液加入量為0.5 mL。

2.2 食源性多酚對α-淀粉酶的抑制作用

多酚對α-淀粉酶的抑制作用主要認為是由二者之間的結合作用力引起的,如疏水相互作用力[19,20],氫鍵力[21-23]等。由圖1和表1可知,3種不同的食源性多酚對α-淀粉酶具有不同程度的抑制作用。隨著多酚質量濃度的增加,食源性多酚對α-淀粉酶的抑制作用也逐漸增強。由回歸方程可求得3種食源性多酚對α-淀粉酶的半抑制質量濃度IC50。其中,蘆丁對α-淀粉酶的抑制作用最大,其半抑制質量濃度IC50為6.53 mg/mL;阿魏酸對α-淀粉酶的抑制作用最小,其半抑制質量濃度IC50為15.38 mg/mL。3種食源性多酚對α-淀粉酶的抑制作用強弱順序為:蘆丁>沒食子酸>阿魏酸。這可能是由于3種多酚的結構不同,導致與α-淀粉酶所結合的結合位點、結合強弱不同,因此抑制效果有所不同。黃酮類化合物可能通過—OH基團與淀粉酶之間形成氫鍵抑制淀粉酶的活性[12];酚酸可以形成高度共軛的體系,在一定程度上阻礙了酚酸-酶的相互作用[24];沒食子酰基的存在使得淀粉酶活性大大降低[21]。可以通過熒光光譜、圓二色譜法、分子對接等分析方法進一步探究3種食源性多酚與淀粉酶之間的結合作用[13,25,26]。

圖1 3種食源性多酚對α-淀粉酶的抑制作用

表1 3種食源性多酚的抑制曲線方程及IC50值

2.3 3種食源性多酚對α-淀粉酶的抑制類型

根據不同多酚與α-淀粉酶的相互結合作用,抑制劑對α-淀粉酶的抑制作用可以分為可逆性抑制作用與不可逆性抑制作用2種抑制類型[17]。3種食源性多酚對α-淀粉酶的抑制作用如圖2所示。速率曲線均通過原點,由此可以判斷3種食源性多酚對α-淀粉酶的抑制類型為可逆性抑制。且當3種食源性多酚質量濃度均為6 mg/mL時,阿魏酸、沒食子酸、蘆丁的速率曲線的斜率依次下降,表明酶促反應初速率依此減小。可進一步證明3種食源性多酚對α-淀粉酶的抑制作用強弱順序為:蘆丁>沒食子酸>阿魏酸。

圖2 3種食源性多酚對α-淀粉酶的抑制動力學曲線

2.4 計算α-淀粉酶的米氏常數

按照1.4.5.3的方法,對α-淀粉酶的米氏常數進行測定與計算。根據中間復合物假說、利用Lineweaver-Burk雙倒數作圖法,將米氏方程兩邊取倒數,可以得到式(2)[27]:

(2)

式中:v為初始反應速度;Km為米氏常數;Vmax為最大初始反應速度;S為底物濃度。

以反應物濃度的倒數1/[S]作為橫坐標,以反應速率的倒數1/V作為縱坐標,繪制Lineweaver-Burk雙倒數曲線圖,見圖3。所擬合出的曲線方程為y=77.0730 1x+6.181 93,R2=0.994 6根據曲線與x軸交點的橫坐標、y軸交點的縱坐標可計算出Km=12.47 mg/mL,Vmax=0.161 7 mg/(mL·min)。

圖3 α-淀粉酶的Lineweaver-Burk雙倒數曲線圖

2.5 3種食源性多酚對α-淀粉酶的抑制動力學分析結果

為進一步確定3種食源性多酚對α-淀粉酶的可逆抑制類型及相關抑制常數,通過建立Lineweaver-Burk雙倒數曲線作圖、Dixon曲線圖和Cornish-Bowden曲線圖,確定可逆抑制類型并求得相關抑制常數,探究多酚濃度、反應物濃度以及酶促反應速率之間的關系,求得相關抑制常數。

3種食源性多酚對α-淀粉酶的Lineweaver-Burk雙倒數曲線如圖4所示。可以監測米氏常數Km與最大反應速率Vmax隨抑制劑濃度的變化,直線在y軸上的截距為1/Vmax,直線斜率為Km/Vmax。由圖4可知,在阿魏酸與蘆丁的實驗組中,不同多酚濃度的速率直線在第二象限存在交點。隨著多酚濃度的增加,Vmax減小而Km增加,符合競爭-非競爭性混合抑制的特點;在沒食子酸的實驗組中,不同多酚濃度的速率直線在第三象限存在交點,隨著多酚濃度的增加,Vmax和Km均增加,符合非競爭-反競爭性混合抑制的特點。

通過Lineweaver-Burk雙倒數曲線作圖法在底物濃度較低時存在一定誤差[28],最好通過Dixon圖法與Cornish-Bowden圖法進一步驗證抑制類型并確定相關抑制常數Kic與Kiu。混合型抑制的相關Dixon方程與Cornish-Bowden方程見式(3)和式(4)[29]:

(3)

(4)

式中:i為抑制劑質量濃度;Kic為抑制劑與酶的解離常數;Kiu為抑制劑與酶-底物復合物的解離常數。

通過對方程兩邊取倒數進行作圖,Dixon曲線圖可表示為1/V對[i]的線性圖,對Cornish-Bowden方程兩邊進行取倒數作圖,Cornish-Bowden曲線圖可以表示為S/V對[i]的線性圖。根據3種食源性多酚對α-淀粉酶抑制動力學的Dixon曲線圖(圖5)與Cornish-Bowden曲線圖(圖6),可求得相關抑制常數及方程式如表2所示。

圖5 3種食源性多酚對α-淀粉酶反應的Dixon圖

圖6 3種食源性多酚對α-淀粉酶的Cornish-Bowden圖

表2 3種食源性多酚對α-淀粉酶的抑制常數及抑制方程

根據酶促反應動力學原理可知,當KicKiu時,反應抑制類型為非競爭性和反競爭性混合抑制。通過對結果進行分析比較,可以進一步確定阿魏酸、蘆丁對α-淀粉酶的抑制作用為競爭性和非競爭性混合抑制,沒食子酸對α-淀粉酶的抑制作用為非競爭性和反競爭性混合抑制。Kic越低,表示抑制劑與酶的結合作用越強;Kiu越低,表示抑制劑-酶-底物三元絡合物的穩定性越強[28]。由表2數據可知,在3種食源性多酚中,α-淀粉酶與蘆丁的結合最緊密,沒食子酸與α-淀粉酶-大米淀粉復合物的結合穩定性最強。

3 結論

實驗以大米淀粉為底物,確定反應的最適條件,反應溫度37 ℃,反應時間3 min,酶濃度0.2 U/mL,加酶量0.5 mL,研究α-淀粉酶的酶促反應動力學,并進一步探究了阿魏酸、沒食子酸和蘆丁3種食源性多酚對α-淀粉酶活性的抑制作用。結果表明,3種食源性多酚對α-淀粉酶具有良好的抑制效果,且抑制作用與多酚濃度,呈正相關。3種食源性多酚對α-淀粉酶的抑制強弱效果為蘆丁>沒食子酸>阿魏酸,其半抑制濃度IC50分別為6.53、11.87、15.38 mg/mL。

通過抑制動力學實驗以及分析方程圖可知,以大米淀粉為底物時,阿魏酸、蘆丁對α-淀粉酶的抑制類型為競爭性和非競爭性混合抑制,沒食子酸對α-淀粉酶的抑制類型屬于非競爭性和反競爭性混合抑制。通過對相關抑制常數Kic與Kiu進行求值并分析,可知α-淀粉酶與蘆丁的結合最緊密,沒食子酸與α-淀粉酶-大米淀粉復合物的結合穩定性最強。這可能是由于多酚的結構不同導致的多酚、淀粉酶、底物三者之間的結合作用不同,其中具體結合位點以及作用機制需要進行進一步探究。利用Dixon曲線圖與Cornish-Bowden曲線圖法進一步得到在本實驗條件下阿魏酸、沒食子酸、蘆丁對α-淀粉酶的抑制動力學方程:v=(0.229 0S+4.505 4)/i+0.012 97S+0.161 7、v=(0.281 7S+2.930 0)/i+0.0129 7S+0.161 7、v=(0.101 5S+5.405 6)/i+0.012 97S+0.161 7。