基于超濾-HPLC-MS/MS技術(shù)的苦蕎提取物抑制線粒體腫脹活性研究

江林娟, 韓 林, 李云龍, 王 敏

(西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院1,楊凌 712100) (西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院2,楊凌 712100) (山西農(nóng)業(yè)大學(xué)山西功能食品研究院3,太原 030031)

苦蕎中含有豐富的營養(yǎng)活性成分,除了淀粉、蛋白質(zhì)和脂肪外,多酚類物質(zhì)在苦蕎中的含量非常豐富,游離酚和結(jié)合酚含量分別為0.98～9.31、0.04～0.49 g/100 g DW,并且這些酚類物質(zhì)主要存在于苦蕎麩皮和殼中[1-3]。苦蕎中的酚類物質(zhì)主要由蘆丁、槲皮素和酚酸,如p-羥基苯甲酸、原兒茶酸、沒食子酸等組成,其中蘆丁和槲皮素含量可達(dá)6.06～18.67、0.31～2.38 mg/g DW[1, 4]。同時(shí),苦蕎還含有豐富的D-手性肌醇、D-蕎麥堿和山奈酚等活性成分。大量研究表明,苦蕎具有顯著的降血糖、降血壓、抗氧化、改善炎癥、抗癌和保肝活性[5-7]。Lee等[8]報(bào)道了苦蕎提取物中的蘆丁和槲皮素可通過提高抗氧化酶的活性,有效降低天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶和堿性磷酸酶水平,改善CCl4和酒精誘導(dǎo)的肝臟損傷。同時(shí),Wang等[9]也發(fā)現(xiàn)蕎麥麩皮提取物中的黃酮物質(zhì)在Ⅱ型糖尿病小鼠模型和HepG2細(xì)胞中均可有效發(fā)揮肝臟保護(hù)作用。

超濾-HPLC-MS/MS技術(shù)由生物親和超濾、高效液相色譜與質(zhì)譜分析組成。將親和靶標(biāo)(受體、酶、線粒體等)與多組分的提取物進(jìn)行孵育,促進(jìn)活性小分子化合物與靶標(biāo)結(jié)合形成復(fù)合物,通過超濾技術(shù)將結(jié)合的小分子化合物分離后,利用HPLC-MS/MS技術(shù)進(jìn)行鑒定[10]。Yang等[11]以線粒體為親和靶標(biāo)從葛根和川芎分離鑒定出23種活性成分,其中6種活性物質(zhì)可有效改善線粒體功能。線粒體腫脹源于線粒體膜電位的缺失及線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mPTP)的開放。mPTP的過度開放會(huì)導(dǎo)致線粒體應(yīng)激和功能障礙,主要表現(xiàn)為線粒體腫脹、線粒體膜電位下降、線粒體呼吸鏈功能受損、ATP生成減少以及ROS生成和釋放增加,從而影響線粒體功能[12-14]。因此,利用超濾-HPLC-MS/MS技術(shù),深入研究苦蕎中靶向肝臟線粒體發(fā)揮功能活性的物質(zhì)基礎(chǔ),為開發(fā)相關(guān)的營養(yǎng)健康食品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苦蕎種子(西農(nóng)9940);C57BL/6J雄性小鼠,5周齡,購自西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心;槲皮素、山奈酚、大黃素和L-蘋果酸等(純度≥95%);實(shí)驗(yàn)用水均為蒸餾水;其他常規(guī)試劑如無水乙醇、丙酮、碳酸鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁等均為分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

FW100高速萬能粉碎機(jī),LGJ-25G真空冷凍干燥機(jī),Spark酶標(biāo)儀,HC-2516高速離心機(jī),LC-30A+TripleTOF5600+高分辨離子淌度液質(zhì)聯(lián)用儀,10 ku超濾管,KH-700DE超聲波清洗器。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 提取物的制備

將苦蕎干燥后置于FW100型高速萬能粉碎機(jī)中粉碎0.5 min,過40目篩網(wǎng),再過80目篩網(wǎng),分別得到苦蕎殼粉、苦蕎麩皮粉和苦蕎芯粉。分別稱取一定質(zhì)量的苦蕎3種不同部位的粉末,根據(jù)前期提取方法,按照1∶4的質(zhì)量比分別加入體積分?jǐn)?shù)為80%乙醇、30%丙酮和蒸餾水[15],置于40 ℃,超聲(80 kHz)提取20 min,4 000 r/min離心15 min,取上清液,沉淀再重復(fù)提取2次,收集上清液,置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀內(nèi)濃縮后,再進(jìn)行冷凍干燥,分別得到乙醇-芯粉提取物(YX)、乙醇-麩皮粉提取物(YF)、乙醇-殼粉提取物(YK)、丙酮-芯粉提取物提取物(BX)、丙酮-麩皮粉提取物(BF)、丙酮-殼粉提取物(BK)、水-芯粉提取物(SX)、水-麩皮粉提取物(SF)、水-殼粉提取物(SK),于-20 ℃條件下保存待用。

1.3.2 總酚和總黃酮的測定

提取物中總酚的測定參考楊紅葉等[16]報(bào)道的方法進(jìn)行測定。用50 mL容量瓶配制質(zhì)量濃度為1 mg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。用蒸餾水將沒食子酸稀釋成質(zhì)量濃度為0、20、40、60、80、100、120、140、160 μg/mL的溶液,分別取上述不同濃度的溶液125 μL,加入500 μL蒸餾水和125 μL福林酚試劑,震蕩混合,室溫避光反應(yīng)6 min,加入1.25 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7% Na2CO3溶液,室溫下避光靜置90 min,以標(biāo)準(zhǔn)曲線的“0”管為空白,在760 nm波長處測定吸光度,繪制得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=25.1x+0.020 2,R2=0.995 4。將9種苦蕎提取物進(jìn)行復(fù)溶后,分別取125 μL,加入500 μL蒸餾水和125 μL福林酚試劑,避光反應(yīng)6 min,加入1.25 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7% Na2CO3溶液,震蕩混勻,室溫避光條件下反應(yīng)90 min,用分光光度計(jì)在760 nm波長處測定反應(yīng)液的吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算各提取物中總酚的含量,結(jié)果以1 g樣品中所含沒食子酸的當(dāng)量毫克數(shù)表示(mg GA/g DW)。

提取物中總黃酮的測定參考國旭丹等[17]的方法進(jìn)行測定。用10 mL容量瓶配制質(zhì)量濃度為200 μg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mL于5 mL的棕色容量瓶中,加入200 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5% NaNO2溶液,室溫避光放置6 min,加入200 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10% Al(NO3)3溶液,室溫避光放置6 min,分別加入2 mL 1 mol/L NaOH溶液,用蒸餾水定容至5 mL,避光反應(yīng)15 min后測定510 nm波長處的測定吸光值,繪制得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=9.520 8x+0.005 4,R2=0.997 2。量取150 μL提取物溶液于5 mL棕色容量瓶中,加入200 μL 5% NaNO2溶液混合均勻后靜置6 min,再加入200 μL 10%的Al(NO3)3溶液,避光反應(yīng)6 min后加入2 mL 1 mol/L NaOH溶液,用蒸餾水定容,避光放置15 min后于510 nm波長處測定吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算各提取物中總黃酮的含量,結(jié)果以1 g樣品中所含蘆丁的當(dāng)量毫克數(shù)表示(mg rutin/g DW)。

1.3.3 線粒體腫脹抑制實(shí)驗(yàn)

將禁食12 h的小鼠脫頸處死后,迅速取出肝組織,用預(yù)冷的生理鹽水洗滌2次,然后利用組織線粒體分離試劑盒提取肝臟線粒體。參考沈美榮[18]的研究方法,將線粒體重懸后,利用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。吸收線粒體懸浮液25 μL,加入150 μL苦蕎不同溶劑提取物(10 mg/mL),混勻,37 ℃反應(yīng)3 min,然后加入12.5 μL FeSO4(終濃度為300 μmol/L)溶液和12.5 μL的VC溶液(終濃度為5 mmol/L),37 ℃避光孵育10 min,在37 ℃下觀察反應(yīng)液在540 nm處,30 min內(nèi)的吸光值變化。以緩沖液代替造模試劑和樣品分別作為空白組和模型組。本次動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已通過西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核,符合動(dòng)物保護(hù)、動(dòng)物福利和倫理原則,符合國家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理的相關(guān)規(guī)定,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)許可證編號(hào):SYXK(陜)2020-005。

1.3.4 超濾-HPLC-MS/MS

將YF復(fù)溶后,配制成質(zhì)量濃度為5 mg/mL的溶液,取5 μL的YF溶液加入到200 μL線粒體懸液中,于37 ℃孵育60 min,然后轉(zhuǎn)移至超濾管(10 ku)中,在4 ℃下以14 000 g離心25 min,棄去濾液,再加入200 μL,50 mmol/L,pH 7.5的乙酸銨緩沖液進(jìn)行洗滌,重復(fù)3次。洗滌后,每管加入體積分?jǐn)?shù)為80%甲醇400 μL超聲(80 kHz)裂解20 min,然后14 000 g離心25 min,將結(jié)合的活性化合物從線粒體中分離,收集濾液,凍干備用。凍干粉經(jīng)100 μL 80%甲醇水溶液重溶后,進(jìn)行HPLC-MS/MS分析[19]。將鑒定出的活性成分配制成10 mg/mL的濃度,研究其對(duì)肝臟線粒體腫脹的抑制作用。

1.3.5 線粒體膜電位檢測

將HepG2細(xì)胞接種于6孔板中,待細(xì)胞生長至85%左右時(shí),用PBS清洗細(xì)胞3次,再加無血清培養(yǎng)基饑餓處理3 h,按如下分組處理24 h后,棄去培養(yǎng)基,加入1 mL JC-1,37 ℃避光孵育20 min后,吸除上清,用JC-1染色緩沖液洗滌2～3次,再加入2 mL無血清DMEM高糖培養(yǎng)基,置于倒置熒光顯微鏡中拍照觀察,利用Image J軟件進(jìn)行熒光定量分析,以相對(duì)熒光強(qiáng)度(空白組為100%)表示線粒體膜電位水平[20]。

實(shí)驗(yàn)分為:空白組:高糖無血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng);高脂組:高糖無血清DMEM培養(yǎng)基孵育+100 μmol/mL的棕櫚酸(PA)培養(yǎng);活性物質(zhì)組:高糖無血清DMEM培養(yǎng)基孵育,各孔分別加入槲皮素、山奈酚、大黃素和L-蘋果酸(終質(zhì)量濃度100 μmol/L)預(yù)保護(hù)30 min后,再與100 μmol/mL的PA共孵育。

1.3.6 ROS水平檢測

將HepG2細(xì)胞接種于96孔板中,待細(xì)胞生長至85%左右時(shí),用PBS清洗細(xì)胞3次,再加無血清培養(yǎng)基饑餓處理3 h,然后按如下實(shí)驗(yàn)分組處理24 h后,棄去培養(yǎng)基,加入ROS檢測探針DCFH-DA(10 μmol/mL),置于37 ℃,避光孵育30min,再用PBS洗掉未與細(xì)胞結(jié)合的探針染料,利用酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞的熒光強(qiáng)度,以熒光強(qiáng)度表示細(xì)胞中的ROS水平。每組重復(fù)6次[21]。

實(shí)驗(yàn)分組為:空白組為高糖無血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng);高脂組為高糖無血清DMEM培養(yǎng)基孵育+100 μmol/mL的棕櫚酸(PA)培養(yǎng);活性物質(zhì)組為高糖無血清DMEM培養(yǎng)基孵育,各孔分別加入槲皮素、山奈酚、大黃素和L-蘋果酸(終濃度100 μmol/L)預(yù)保護(hù)30 min后,再與100 μmol/mL的PA共孵育。

1.4 數(shù)據(jù)處理方法

利用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理和作圖,并通過單因素方差分析(one-way ANOVA)進(jìn)行顯著性比較(P<0.05),實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示。利用Image J軟件進(jìn)行熒光定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦蕎中總酚和總黃酮的含量

由表1可知,苦蕎不同部位不同溶劑提取物中均含有豐富的總酚和總黃酮,其中80%乙醇提取物中總酚和總黃酮含量顯著高于30%丙酮和水提取物。根據(jù)相似相溶原理,說明苦蕎中的總酚和總黃酮更易溶解于80%乙醇溶液中,并且兩者在麩皮粉中的含量最高,分別達(dá)(32.48±0.37)mg GA/g DW和(63.06±0.21)mg rutin/g DW,殼粉次之,芯粉最少。Guo等[1]研究表明,苦蕎中游離態(tài)和結(jié)合態(tài)多酚主要存在于麩皮和殼中,而芯粉中含量較少,這與本研究結(jié)果一致,在不同溶劑提取物中,麩皮粉和殼粉中總酚和總黃酮含量顯著高于芯粉,表明保留麩皮的全谷物苦蕎產(chǎn)品營養(yǎng)價(jià)值更為豐富。

表1 苦蕎中總酚和總黃酮的含量

2.2 苦蕎提取物對(duì)肝臟線粒體腫脹的抑制作用

線粒體腫脹是線粒體功能紊亂的表觀特征之一,隨著線粒體外膜受損,線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的開放,導(dǎo)致線粒體發(fā)生腫脹。高脂誘導(dǎo)的線粒體腫脹會(huì)導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡,引起肝臟脂肪變性,通過活性物質(zhì)干預(yù),抑制線粒體腫脹可有效改善肝臟功能[22, 23]。線粒體腫脹度可根據(jù)線粒體懸液的吸光度判斷,在540 nm處,線粒體懸液的吸光度與線粒體腫脹度成反比,吸光度越低,說明線粒體腫脹程度越嚴(yán)重[24]。由圖1可知,采用FeSO4-VC造模可顯著降低肝臟線粒體溶液的吸光度,說明FeSO4-VC可誘導(dǎo)線粒體腫脹,成功造模。苦蕎不同溶劑提取物對(duì)肝臟線粒體的腫脹均有抑制作用,其中苦蕎80%乙醇提取物可有效提高線粒體懸液的吸光度,抑制線粒體腫脹,而YF處理組效果最好,與模型組相比,孵育30 min后,對(duì)肝臟線粒體腫脹的抑制率達(dá)到34.16%。線粒體腫脹會(huì)導(dǎo)致其膜電位下降,ATP生成減少以及ROS增加,并引起細(xì)胞色素C“泄漏”至細(xì)胞質(zhì)中造成細(xì)胞的凋亡[25]。表明,苦蕎YF中的活性成分可通過抑制FeSO4-VC誘導(dǎo)的肝臟線粒體腫脹,有效改善線粒體功能,發(fā)揮肝臟保護(hù)作用。

圖1 苦蕎不同溶劑提取物對(duì)肝臟線粒體腫脹的抑制作用

2.3 超濾-HPLC-MS/MS分析

超濾-HPLC-MS/MS實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。結(jié)果表明,苦蕎80%乙醇麩皮粉提取物(YF)中,與肝臟線粒體親和力較強(qiáng)的活性物質(zhì)分別是槲皮素、山奈酚、大黃素和L-蘋果酸。槲皮素是蘆丁的水解產(chǎn)物之一,兩者均為苦蕎中主要的酚類物質(zhì),含量分別為0.31～2.38 mg/g DW和6.06～18.67 mg/g DW[26, 27]。同時(shí),山奈酚也普遍存在于苦蕎種子、芽、花和葉中,大黃素主要發(fā)現(xiàn)于苦蕎種子中,而L-蘋果酸則是蕎麥中常見的有機(jī)酸[3, 28]。表明,苦蕎80%乙醇麩皮粉提取物(YF)中與肝臟線粒體親和力較強(qiáng),從而發(fā)揮線粒體腫脹抑制作用的活性物質(zhì)主要是槲皮素、山奈酚、大黃素和L-蘋果酸。前期已有研究發(fā)現(xiàn),槲皮素、山奈酚和大黃素均可有效改善線粒體功能,發(fā)揮線粒體保護(hù)作用,而有關(guān)L-蘋果酸對(duì)線粒體功效的研究報(bào)道較少[29-31]。

表2 超濾-HPLC-MS/MS分析結(jié)果

2.4 活性成分對(duì)線粒體腫脹的改善作用

為了進(jìn)一步驗(yàn)證超濾-HPLC-MS/MS的結(jié)果,我們研究了槲皮素、山奈酚、大黃素和L-蘋果酸對(duì)FeSO4-VC誘導(dǎo)肝臟線粒體腫脹的抑制作用。由圖2可知,4種活性成分均可有效抑制肝臟線粒體腫脹,與模型組相比,孵育30 min后,對(duì)肝臟線粒體腫脹的抑制率分別為16.04%、15.16%、5.90%和4.08%,表明槲皮素和山奈酚對(duì)線粒體腫脹的抑制活性顯著強(qiáng)于大黃素和L-蘋果酸。然而,單一活性成分抑制線粒體腫脹的效果弱于苦蕎80%乙醇麩皮粉提取物(YF),表明提取物中活性成分可協(xié)同發(fā)揮線粒體保護(hù)作用。

圖2 活性成分對(duì)肝臟線粒體腫脹的改善作用

2.5 活性成分對(duì)HepG2細(xì)胞線粒體膜電位的影響

線粒體膜電位是評(píng)估線粒體功能的重要指標(biāo)之一[32]。為了進(jìn)一步證實(shí)這4種活性物質(zhì)對(duì)肝臟線粒體腫脹的抑制,從而改善線粒體功能紊亂的活性,我們?cè)贖epG2細(xì)胞中研究了4種活性物質(zhì)對(duì)線粒體膜電位的影響。由圖3可知,與空白組相比,高脂處理(PA組)24 h顯著降低了HepG2細(xì)胞中線粒體的膜電位,而槲皮素和山奈酚處理組則有效恢復(fù)了線粒體膜電位,但大黃素和L-蘋果酸處理組卻沒有明顯的效果,說明槲皮素和山奈酚是苦蕎中抑制線粒體腫脹,提高線粒體膜電位的主要活性成分,這與Han等[30]和Guo等[33]的研究報(bào)道一致。

圖3 活性物質(zhì)對(duì)HepG2細(xì)胞線粒體膜電位的影響

2.6 活性成分對(duì)HepG2細(xì)胞中ROS水平的影響

ROS的主要來源是線粒體,在氧化磷酸化過程中,電子從復(fù)合物Ⅰ和復(fù)合物Ⅲ中“泄漏”,與氧氣結(jié)合后,形成的超氧陰離子是一種重要的ROS。當(dāng)線粒體功能出現(xiàn)紊亂時(shí),ROS水平會(huì)顯著上升[34]。由圖4可知,100 μmol/L的4種活性物質(zhì)處理24 h均可降低高脂誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞中ROS的積累,但L-蘋果酸處理效果并不顯著,而槲皮素和山奈酚處理則可分別降低細(xì)胞中27.47%和25.80%的ROS水平,說明這2種活性成分清除ROS,從而發(fā)揮線粒體保護(hù)作用的效果優(yōu)于L-蘋果酸和大黃素。線粒體腫脹會(huì)導(dǎo)致其呼吸鏈功能受損,特別是電子傳遞鏈中復(fù)合物Ⅰ出現(xiàn)障礙后,會(huì)生成過多的ROS,ROS過多反過來也會(huì)導(dǎo)致mPTP的持續(xù)開放,造成線粒體腫脹[23]。從苦蕎中鑒定出的槲皮素和山奈酚可有效抑制高脂誘導(dǎo)的肝臟線粒體腫脹,從而減少ROS的生成,但其中的分子作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

圖4 活性物質(zhì)對(duì)高脂誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞中ROS水平的影響

3 結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)苦蕎乙醇-麩皮粉提取物(YF)對(duì)FeSO4-VC誘導(dǎo)的小鼠肝臟線粒體腫脹具有顯著的抑制作用。利用超濾-HPLC-MS/MS技術(shù)分離和鑒定出苦蕎YF中發(fā)揮線粒體腫脹抑制作用的活性成分主要是槲皮素、山奈酚、大黃素和L-蘋果酸,其中槲皮素和山奈酚可有效恢復(fù)高脂誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞的線粒體膜電位,顯著降低細(xì)胞中的ROS水平,從而改善線粒體功能。本研究初探了苦蕎中抑制肝臟線粒體腫脹的活性物質(zhì)基礎(chǔ),為深入開發(fā)保護(hù)線粒體的苦蕎營養(yǎng)健康食品提供了參考,后續(xù)工作將圍繞槲皮素和山奈酚改善線粒體腫脹的分子作用機(jī)制開展進(jìn)一步的研究。