法舒地爾對大鼠脊髓損傷Rho/ROCK2激酶及鐵死亡的影響

翟永喜,孫林林

1.鄭州市第七人民醫院骨科,鄭州 450000; 2.鄭州市第七人民醫院神經外科,鄭州 450000

交通事故、墜落、自然災害常常導致身體多發損傷,而脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)是臨床常見的創傷性中樞神經疾病[1],具有較高的病死率及致殘率,嚴重影響患者的生活質量,給家庭及社會經濟帶來沉重的負擔[2]。目前SCI仍是骨科和神經外科治療的熱點和難點[3]。原發性SCI后常伴繼發性損傷,發生神經細胞的病理生理改變(細胞自噬、凋亡、焦亡等),進一步引起神經組織的相關損傷,因此針對減輕SCI后神經損傷的保護性藥物及相關機制的研究至關重要[4-5]。鐵死亡是神經細胞死亡的重要方式,其主要特征是依賴鐵的程序性死亡方式,產生大量活性氧(reactive oxygen species,ROS),導致谷胱甘肽過氧化物酶4(GPX4)減少,引起細胞損傷或死亡。既往研究[6-7]表明,鐵死亡在SCI中存在形態學及分子細胞水平的證據,且抑制劑去鐵胺干預鐵死亡后修復了SCI,改善了大鼠的肢體功能。目前很多研究證實,抑制鐵死亡具有神經保護作用,特別對創傷性神經損傷具有修復作用,然而影響鐵死亡的關鍵蛋白尚處于探索階段。

法舒地爾(fasudil hydrochloride,Fasudil)是異喹啉磺酰類藥物,是一種血管擴張劑,通過抑制肌球蛋白輕鏈磷酸化,進一步作用于Rho/ROCK激酶發揮作用,主要影響細胞骨架分化遷移、平滑肌收縮等多種功能,參與細胞生長、發育、遷移和凋亡等生命活動[8]。ROCK1與ROCK2是Rho激酶(Rho亞家族蛋白A/相關卷曲螺旋形成蛋白激酶,ROCK)的亞型,互為同分異構體,ROCK2主要在神經系統中聚集[9]。而Fasudil以及Rho/ROCK2激酶對SCI大鼠鐵死亡的研究國內外報道甚少。本研究通過撞擊法制備大鼠SCI模型,給予法舒地爾進行治療,觀察SCI大鼠Rho/ROCK2激酶及鐵死亡相關蛋白的變化,對SCI發生的分子機制進行研究,為SCI的臨床救治提供新的理論基礎。

材料與方法

1 材料

1.1實驗動物 成年雄性SD大鼠,12周齡(體質量225.2～245.5g),購于鄭州市華興實驗動物養殖場,于鄭州市第七人民醫院6號樓動物實驗中心飼養,光照及黑暗各12h交替,動物房溫度22℃,食水自由,操作輕柔減少不良反應及大鼠的痛苦。本研究所有動物的處理及操作通過鄭州市第七人民醫院醫學倫理委員會審批(20191015)。

1.2主要試劑與儀器 Fasudil注射液 (天津紅日藥業,30mg;2mL,中國),鐵檢測試劑盒、活性氧( Reactive oxygen species,ROS)(碧云天生物有限公司,中國),Rho/ROCK2抗體(Wanleibio,中國),xCT及GPX4抗體(Abcam公司,英國)、PVDF膜(Millipore公司,美國),DAB顯色試劑盒(中杉金橋,中國),冰箱(-20℃,-80℃,海爾公司,中國),電轉儀、電泳儀(北京六一,中國)。微量轉移器(Eppendorf公司,德國)。

2 方法

2.1動物分組與SCI模型制作[10]大鼠編碼后按隨機數字表法分Sham組(假手術組)、SCI組(脊髓損傷組)、Fasudil組(SCI+ Rho/ROCK2抑制劑Fasudil組),各12只。大鼠腹腔注射戊巴比妥(2%,50mg/kg)麻醉,麻醉成功后俯臥位于大鼠固定裝置,皮膚消毒并切開,暴露T9～T11,咬骨鉗咬除T9～T11棘突及椎板等骨性組織,顯微剪刀剪開硬脊膜,顯微鑷子打開暴露頸髓。用脊髓損傷器準確撞擊大鼠脊髓(高度6cm,重量10g),制備SCI模型,逐層縫合,消毒并包扎。保溫復蘇后繼續飼養。造模成功標準:硬膜下大鼠軀體及雙下肢痙攣性回縮,癱瘓狀態。術后每天進行膀胱按摩2次促進排尿,直至排尿功能恢復。大鼠無死亡及傷口感染。

Sham組只咬除T9～T11棘突及椎板等骨性組織,不造成SCI。Fasudil組:造模成功后每日1次腹腔注射Fasudil(10mg/kg),治療2周[11]。Sham組與SCI組給予同劑量生理鹽水。

2.2Basso-Beattie-Bresnahan locomotor scale(BBB)評分 各組大鼠分別于第1、3、7、14、21、28天進行BBB評分。大鼠放置于盆中,輕敲使其爬行,觀察并記錄四肢運動及協調情況,BBB評分包括:后肢運動及活動度(0～7分),后肢的步態及前后肢體協調(8～13分),運動中足趾及尾巴精細動作(14～21分)。后肢全癱無活動為0分,活動正常為21分。BBB評分結束后進行組織檢測。

2.3Fe2+含量檢測 麻醉大鼠,取各組大鼠脊髓組織,洗滌、勻漿、離心后取上清液待測,配制工作液,按順序加入待測液,形成絡合物,在波長520nm檢測吸光值,計算并記錄Fe2+含量。

2.4ROS含量檢測 麻醉大鼠,取各組大鼠脊髓組織,酶解法分解,2’,7’-二氯二氫熒光素二乙酸酯(DCFH-DA) ROS熒光探針檢測樣品中ROS含量(詳細步驟按ROS試劑盒說明書進行操作),激發波長為502nm,發射波長為530nm附近波峰最大,結果用平均熒光強度表示。

2.5免疫印跡法實驗 麻醉大鼠,于損傷部位上下收集脊髓組織,存于-80℃,用時取出放置于EP管中剪碎,超聲震碎,溶解于裂解液中,離心取上清液,測定蛋白濃度,配比取20μg蛋白上樣,濃縮膠分離膠電泳,PVDF轉膜,封閉。加入抗體xCT(1∶1200),GPX4(1∶1200),β-actin(1∶5000),二抗孵育,ECL顯影保存條帶,Image J軟件定量條帶灰度值,β-actin為內參對照。

3 統計分析

結 果

1 運動功能

BBB評分評估大鼠28d內的運動功能情況,Sham組評分正常, SCI組大鼠評分均低于Shan組(P<0.05),隨著時間的延長,SCI大鼠的評分逐漸升高。 對比SCI組,Fasudil組第14、21 及28天時明顯改善[(9.58 ± 2.19)分vs.(6.33 ± 2.35)分,t=4.33,P<0.05]、[(13.83 ± 4.47)分vs.(8.92 ± 2.47)分,t=5.90,P<0.05]、[(15.67 ± 4.36)分vs.(12.08 ± 2.65)分,t=2.98,P<0.05]。這表明SCI后大鼠運動功能逐漸恢復,而使用Fasudil治療后BBB評分進一步升高,進一步促進了大鼠的運動功能的恢復。見圖1。

圖1 Fasudil增加大鼠的BBB評分,與Sham組比較,aP<0.05,bP<0.05,cP<0.05;與SCI組比較:aP<0.05,bP<0.05,cP<0.05

2 Fe2+含量

Sham組脊髓組織Fe2+含量較低為(84.2±11.2)%,對比Sham組,SCI組SCI部位組織Fe2+含量明顯增多(176 .7±31.5)%(t=5.91,P<0.001)。對比SCI組, Fasudil組SCI部位組織Fe2+含量明顯降低(127.8±33.1)%(t=3.11,P<0.05)。見圖2。

圖2 各組大鼠SCI部位組織Fe2+含量,與Sham組比較,aP<0.001;與SCI組比較:bP<0.05

3 ROS含量

Sham組脊髓組織ROS含量較低為(95.8±12.0)%,對比Sham組,SCI組SCI部位組織ROS含量明顯增多(162.2±28.0)%(t=4.86,P<0.001)。對比SCI組, Fasudil組SCI部位組織ROS含量明顯減少(123.8±27.6)%(t=2.83,P<0.05)。見圖3。

圖3 各組大鼠SCI部位組織ROS含量。與Sham組比較,aP<0.001;與SCI組比較:bP<0.05

4 免疫印跡法中 Rho/ROCK2、xCT及GPX4的變化

Sham組可見Rho/ROCK2少量表達(0.28±0.039),xCT及GPX4大量表達(0.92±0.092)、(0.84±0.21),對比Sham組,SCI組SCI部位組織可見Rho/ROCK2表達增多(0.85±0.13)(t=7.81,P<0.001),xCT及GPX4表達減少(0.39±0.041)及(0.36±0.049)(t=14.43,5.78,P<0.001)。對比SCI組, Fasudil組SCI部位組織可見Rho/ROCK2表達減少(0.65±0.17)(t=2.71,P<0.05),xCT及GPX4表達增多(0.64±0.033)及(0.55±0.11)(t=6.91,2.35,P<0.05)。見圖4。

圖4 a.大鼠SCI組織ROCK2、xCT及GPX4的表達;b.ROCK2/β-actin比值;c.xCT/β-actin比值;d.GPX4/β-actin比值。與Sham組比較:aP<0.001;與SCI組比較:bP<0.05

討 論

各種創傷因素導致SCI后,損傷周圍組織的內外環境受到影響[12],血供被破壞,細胞通透性增強,局部Fe2+含量的增高,鐵超載進一步影響增加了ROS的堆積,抑制神經軸突再生[13]。相關體內研究也發現,在SCI模型中,早期的繼發性SCI的組織內的Fe2+發揮著非常重要作用,與損傷程度呈正相關[14]。本研究中,SCI后脊髓組織的Fe2+及ROS水平明顯升高,這與上述研究結果一致。而使用法舒地爾治療后,大鼠脊髓組織內Fe2+及ROS水平降低,大鼠的BBB評分升高,表明法舒地爾在SCI后可以減輕脊髓受損并改善運動功能。Fe2+含量增多后誘發脂質過氧化,谷胱甘肽大量消耗,GPX4大量失活,抗氧化防御系統調控失衡,脂質醇生成增多,過氧化物蓄積及細胞損傷,誘發鐵死亡[15]。應用鐵死亡特異性抑制劑及鐵螯合劑處理SCI大鼠,在損傷的脊髓組織中發現鐵死亡相關蛋白的表達,降低炎癥因子,促進組織修復,減少了活化的星形膠質細胞,明顯改善大鼠肢體活動[6-7]。這些鐵死亡的體外研究表明,修復SCI的機制可能是通過抑制鐵死亡通路實現,此結論與本研究結論一致,通過法舒地爾進行干預后SCI大鼠脊髓組織中Fe2+含量減少,鐵死亡負調控相關蛋白xCT及GPX4表達增多,鐵死亡減少,大鼠SCI減輕,肢體運動功能改善。筆者推測法舒地爾的具體干預靶點對鐵死亡有重要影響,因此對實驗過程中的Rho/ROCK2激酶進行了檢測。

Rho蛋白是小G蛋白家族的亞家族成員,參與SCI的炎癥反應,對細胞外基質黏附、骨架重組有重要調控作用。SCI的體外實驗[16]中Rho/ROCK2表達異常增高,與大鼠的預后有著密切關系。SCI后神經髓鞘分泌軸突抑制劑,與NgR形成復合物,激活下游級聯反應,通過信號通路及其他旁路激活ROCK2通路,重組細胞骨架,導致軸突塌陷和神經突出生長抑制,抑制細胞間信號傳導及細胞再生[17]。Zhao等[18]研究表明可能反應性星形細胞增生引起的神經膠質瘢痕可能是影響軸突再生的重要原因,通過基因修飾抑制NgR通路后可減少神經膠質瘢痕產生,明顯改善SCI后軸突再生和功能,而NgR可以影響ROCK2通路。因此,RHO/ROCK2激酶是SCI影響的一個重要因素,而RHO/ROCK2激酶對鐵死亡的報道甚少。以上結論與本研究結論相似,SCI后大鼠脊髓中的Fe2+含量增多,ROCK2表達增高,鐵死亡增強,肢體運動功能損傷,而用ROCK2特異性抑制劑法舒地爾治療后Fe2+含量減少,ROCK2表達明顯降低,鐵死亡減弱,大鼠肢體活動改善。RHO/ROCK2激酶的底物種類多,作用靶點多,有潛在的不良反應,后期需要進一步研究及防治。

綜上,法舒地爾可能通過抑制RHO/ROCK2激酶,降低了鐵死亡,改善了大鼠肢體功能,RHO/ROCK2激酶可能是治療SCI的一條重要調節通路。

作者貢獻聲明：翟永喜:實驗實施、論文撰寫;孫林林:SCI模型制作、實驗技術指導、統計分析及論文修改