沙棘果中維生素C含量的測定與探究

＊王晶 劉桂艷 楊玉延 蔡曉月 楊若熙 王貝

（武漢華夏理工學院 湖北 430200）

沙棘富含維生素C，被稱“天然維生素的寶庫”，是一種典型的藥食同源植物。維生素C又名抗壞血酸，抗氧化功能較強[1]，可提高人體免疫力和抵抗力等。沙棘蘊藏的開發價值高達數百億，但相關定性和定量研究較少，導致其相關深產品研發滯后。

測定果蔬中抗壞血酸含量的方法多樣，如滴定分析法、分光光度法、電化學方法、色譜分析法等，各種方法的適用性不同[2]。總抗壞血酸包括脫氫型抗壞血酸、還原型抗壞血酸及二酮古龍糖酸。經活性炭氧化，樣品中還原型抗壞血酸轉為脫氫抗壞血酸，與2,4-二硝基苯肼作用生成紅色脎，且脎在溶液中的含量與總抗壞血酸含量成正比。沙棘果肉顏色隨VC含量變高而加深，要測量其VC含量需掌握高精密度及高準確度的測定方法。本試驗利用2,4-二硝基苯肼作為顯色劑，分光光度法測定其最大吸收波長下的吸光度，將各種測定方法進行對比，并通過改進活性炭含量吸附沙棘果漿中的橘黃色，可定量探索樣品中VC含量[3]，進而提升沙棘利用率、轉化率和商品率，為后續產業發展提供技術支撐。

1.材料與方法

(1)儀器與試劑

沙棘果，某鮮品專營店；抗壞血酸，2,4-二硝基苯肼、硫脲、硫酸，均為國藥集團化學試劑有限公司；草酸，天津市化工三廠有限公司。FA214型電子天平，上海海康電子儀器廠；TU-1900紫外可見光分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；HH-2數顯恒溫水浴鍋，金壇市杰瑞爾電器有限公司。

(2)試劑配制

稱取2g 2,4-二硝基苯肼，溶于100mL 4.5mol/L H2SO4，過濾得2% 2,4-二硝基苯肼溶液。存放于冰箱，用前過濾；在1000mL 1mol/L鹽酸中加入100g活性炭，回流3h后過濾，除去濾液中的無鐵離子（Fe3+）（亞鐵氰化鉀試劑檢驗）。烘箱（110℃）烘干，得無鐵離子活性炭；稱取0.1g抗壞血酸，溶于100mL蒸餾水得1mg/mL VC水溶液；稱取10g硫脲，溶于1000mL蒸餾水得1%硫脲溶液；稱取20g草酸，溶于700mL蒸餾水，加蒸餾水定容至1000mL，得2%草酸溶液；量取500mL 2%草酸溶液，加蒸餾水定容至1000mL，得1%草酸溶液；量取70mL硫酸，緩緩注入20mL水中，不斷攪拌，冷卻后稀釋至100mL，得85%硫酸溶液。

(3)樣品制備

將新鮮沙棘果洗凈擦干，稱取5g放入研缽中，加等體積2%草酸，研成勻漿狀。將勻漿轉移至50mL容量瓶，用1%草酸稀釋至刻度，充分搖勻。現用現配。

(4)氧化液制備

在50mL VC標準溶液中加入1.2g活性炭，搖動1min后過濾。再將50mL濾液、5.0g硫脲加入500mL容量瓶，用1%草酸溶液稀釋至刻度。

(5)標準濃度溶液制備

取10mL、20mL、30mL、40mL、50mL、60mL、70mL稀釋液，分別放入7個100mL容量瓶，用1%硫脲溶液稀釋至刻度，使稀釋液中VC濃度分別為10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL、60μg/mL、70μg/mL[4]。

2.試驗方法

(1)最大吸收波長的測定

按照正交實驗獲得的最優反應條件制備抗壞血酸標準溶液。以未添加抗壞血酸標準溶液組為對照組，在紫外分光光度計設定400～800nm處檢測，確定待檢測溶液的最大吸收波長。

(2)標準曲線的繪制

制備標準濃度溶液，在最大吸收波長、最優實驗條件下分別測定標準濃度的最大吸光度值。以抗壞血酸標準品濃度（C，μg/mL）為橫坐標，以吸光度（A）為縱坐標，根據測得吸光度值繪制標準曲線。

(3)四項單因素實驗

本實驗選取4個主要干擾因素分別開展單因素實驗。在其他主要干擾因素值固定不變條件下，分別探究活性炭用量（1g、1.2g、1.5g），溫度（37℃、38℃、39℃），水浴時間（3h、3.5h、4h），氧化液用量（4mL、5mL、6mL）對抗壞血酸含量測定值的影響，以測量所得吸光度為主要評價指標來篩選各主要干擾反應因素的最優反應條件。

(4)正交實驗

根據上述單因素實驗所得結論，以獲取抗壞血酸含量測定的最優反應條件組合為正交實驗的重要考察指標，選擇活性炭用量（A），溫度（B），水浴時間（C），氧化液用量（D）四個因素作為考察因素，采用四因素正交實驗表的正交實驗方法進行樣品正交實驗。

(5)2,4-二硝基苯肼法

制備樣品溶液，按最優實驗條件實驗，以不添加抗壞血酸溶液為對照組，在396nm處測定其吸光度，將結果帶入繪制的標準曲線中計算VC含量。

精密性實驗：用2,4-二硝基苯肼法對溶液進行VC含量測定，連續多次測定吸光度值，計算沙棘果中VC含量，計算測定的相對標準偏差。

穩定性實驗：用2,4-二硝基苯肼法對溶液進行VC含量測定，每隔20min檢測其吸光度，檢測時間（min）對于吸光度的影響。

加標回收實驗：量取相同體積樣品溶液，分別加入80%、100%、120%質量分數的抗壞血酸，用2,4-二硝基苯肼法測定吸光度，重復三次實驗操作，計算求得其加標回收率。

3.試驗結果與討論

(1)單因素實驗結果分析

①活性炭用量的影響

活性炭作為實驗中的氧化劑，將還原性抗壞血酸氧化為脫氫抗壞血酸。活性炭用量（g）對吸光度（A）的影響，見圖1。可知，在恒定溫度、水浴時間和氧化液用量條件下，活性炭用量不足時，無法完全氧化抗壞血酸，吸光度較不明顯；當活性炭含量達1.2g，對抗壞血酸的氧化達到完全，吸光度顯著且趨于穩定。故選1.2g活性炭為實驗測定條件。

圖1 活性炭用量的影響

②溫度的影響

作為影響脫氫抗壞血酸與2,4-二硝基苯肼反應速度的重要因素，溫度（℃）對吸光度（A）具有顯著影響，見圖2。溫度較低時，反應速度慢，吸光度測定值較低；溫度上升，吸光度隨之顯著上升，在38℃以上趨于平穩。故選38℃為實驗測定條件。

圖2 溫度的影響

③水浴時間的影響

水浴時間直接影響脫氫抗壞血酸與2,4-二硝基苯肼反應程度。本實驗中水浴時間（h）對吸光度（A）影響見圖3。水浴時間不足，脫氫抗壞血酸不能與2,4-二硝基苯肼完全反應生成脎，導致吸光度較低；水浴時間足夠時反應完全，吸光度值不會隨時間增加而上升，在3.5h后趨于穩定。故選3.5h為實驗測定條件。

圖3 水浴時間的影響

④氧化液用量的影響

氧化液用量是影響脎生成的重要因素，吸光度值會隨其增加而增高。若用量不夠，不僅浪費顯色劑，且不足以形成足夠的脎用于吸光度的測定。見圖4。氧化液用量＜4mL，吸光度值較小；氧化液用量＞5mL，吸光度值基本不變。同時考慮比色皿容量大小，故選5mL氧化液用量為實驗測定條件。

圖4 氧化液用量的影響

(2)正交實驗結果分析

正交實驗因素的極差值越大，則該因素的水平變化對實驗測得吸光度值影響越大。如表1所示，四因素對沙棘果中VC含量測定影響的順序為：活性炭用量（A）＞水浴時間（C）＞氧化液用量（D）＞溫度（B）。

表1 正交實驗結果

據實驗，最優反應條件為A2，B2，C2，D2，即1.2g活性炭，38℃溫度，3.5h水浴時間，5mL氧化液用量。

如表2所示，四因素對沙棘果中VC含量測定的影響只有活性炭用量有顯著性差異。

表2 正交實驗方差分析結果

表3 加標回收率實驗

(3)方法驗證結果

①最大吸收波長與線性關系

在其他水平恒定不變的情況下，加入抗壞血酸標準溶液得可見光吸收曲線。經實驗觀察，最大吸收波長為496nm，故選496nm進行測定。

線性范圍評價是測定被測物質濃度或活性的反應曲線接近直線的程度。如圖5，以抗壞血酸標準品溶液濃度為橫坐標，以溶液吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線，得含抗壞血酸標準品溶液的線性回歸方程為y=0.0114x+0.0764，r2=0.9984，且抗壞血酸濃度在10～70μg/mL濃度范圍內具有良好的線性關系。

圖5 標準濃度抗壞血酸線性關系

②精密度

相對標準偏差（RSD）表示精密度，其可接受范圍一般為2.0%以下。2,4-二硝基苯肼法測定VC含量精密度的相對標準偏差為0.63%，精密度較好。

③穩定性

2,4-二硝基苯肼法測定VC含量有較好穩定性，但若實驗時間較長，生成的脎會分解，溶液吸光度會隨時間增加呈現細微下降趨勢。故須在溶液配制后立即檢測。

④加標回收率

2,4-二硝基苯肼法測定VC含量平均加標回收率為102.1%±0.1%，在回收率限度范圍內。說明分析方法對分析物在純溶液或復雜的基制檢測環境中反應能力一致性較強，受基質影響較小。

4.總結與展望

2,4-二硝基苯肼法測定沙棘果中VC含量，其基本原理為氧化生成的脫氫抗壞血酸與顯色劑作用生成紅色化合物，利用分光光度計進行比色、標準曲線計算樣品中VC含量。本實驗以2,4-二硝基苯肼作為顯色劑，活性炭作為氧化劑，活性炭1.2g，溫度38℃，水浴時間3h，氧化液5mL組合測定。精密度高，穩定性強，回收率好，易于推廣，為準確測定沙棘果中VC含量提供依據，可推動高附加值沙棘產品研發，市場前景廣闊。顯然，沙棘中存在大量較強抗氧化性的多酚，目前該方法沒有色譜分離，無法嚴密考慮多酚引起的顯色反應干擾實驗結果。接下來將繼續實驗，經色譜分離后觀察多酚引起的抗氧化性與維生素C的對比，進一步優化實驗數據。