染色法構建對超臨界CO2提取沙棘籽油的過程分析

周 雅, 周雪華, 謝雨波, 嚴曉陽, 王 芳,, 鄧 剛

(浙江省特色經濟植物生物技術研究重點實驗室;浙江師范大學化學與生命科學學院1,金華 321004) (浙江師范大學行知學院理學院2,蘭溪 321100)

沙棘(HippophaerhamnoidesL.)屬胡頹子科沙棘屬落葉灌木,截至2022年在我國種植總面積約為1.273×106hm2,約占世界沙棘種植總面積的55%[1]。成熟的沙棘果年產量為50～60萬t,并且將以每年10%～20%的速度增長,其加工后約產生13.8萬t的沙棘籽[2]。沙棘籽富含油脂,油脂質量分數為8%～20%[3],并且沙棘籽油具有抗氧化、抗菌、促進傷口愈合及抑制心血管疾病等多種生理活性[4],因而在醫藥、食品、日用化工等領域均有廣泛應用[5-7]。

超臨界CO2提取可以從沙棘籽中獲取無污染、純天然的沙棘籽油[8],相比于傳統的提取工藝如機械壓榨法[9]、溶劑提取法[10],該法避免了有機溶劑消耗、熱降解和萃取時間長等弊端,確保了產品的質量,符合綠色發展趨勢[11]。研究加壓提取過程中物料內容物的分布及含量變化,進而構建油脂釋放動力學,對深入了解提取機理、優化工藝及提高油脂品質等方面均有非常重要的意義。隨著油脂染色技術、顯微顯影技術的迅猛發展[12-15],油脂的可視化顯影可以識別并精準定量植物[14]、動物[16]、微生物[17]中的油脂。特別是Mehlem等[16]采用了油紅O對肝細胞中的脂質進行了特異性染色,并構建了分析定量方法,用于病理研究,證實了油紅O相比于其他特異性脂溶性染料,染色后觀察到的脂滴邊界更清晰,且無背景干擾[18,19]。此外,Lopez-ordaz等[14]用油紅O染色法對天然蓖麻種子胚乳細胞進行了顯影,證實了細胞內脂質體形變及脂質去除。然而,前期研究表明,常規ORO染色應用于顯影粉碎干燥后果蔬籽料內油脂時,脂滴經常發生移位,且染色極易過染或不充分,無法滿足對物料內脂滴可視化顯影分析的需求。

研究分析ORO常規染色法用于顯影干物料中沙棘籽油存在的一些問題,對一些關鍵步驟進行改進,新構建ORO逐級染色法,優化新方法的染色間隔時間,調整其染色級數和染液濃度,以獲取最佳的籽油顯影,創建相應的油脂定量方法,評價該方法的精密度和準確性,應用ORO逐級染色法直觀地分析了超臨界CO2提取沙棘籽油的過程。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

沙棘籽采購自甘肅省張掖市民樂縣,于55 ℃鼓風干燥至恒重,經機械研磨后,過40目標準篩,選取粒徑范圍為400～500 μm的顆粒進行后續的研究,真空密封后置于-20 ℃避光儲藏。

油紅O染料(Biological Stain);CO2氣體(純度≥99.9%);Tissue-Tek OCT冷凍包埋劑;乙醚、異丙醇等均為分析純。

油紅O染液的配制:稱取0.5 g油紅O溶解于100 mL異丙醇中,配制成質量濃度5 mg/mL的油紅O母液,使用體積分數60%異丙醇對油紅O母液進行稀釋,得到不同濃度的油紅O工作液。

1.2 實驗儀器

HELIX超臨界天然產物萃取裝置,CM1950冷凍切片機,BX53光學顯微鏡。

1.3 方法

1.3.1 ORO常規染色法和逐級染色法

ORO常規染色法:使用包埋劑對沙棘籽樣品進行包埋,冷凍至-20 ℃,切片,厚度為25 μm。在切片上滴加20 μL 2 mg/mL ORO工作液,靜置3 min后,傾斜去除染液,沖洗切片3次,加蓋玻片進行顯影觀察。

ORO逐級染色法:在樣品切片上,滴加10 μL 60%異丙醇,浸潤1～2 min。然后滴加2 μL的ORO工作液進行第一級的滴染,間隔一定時間后顯影,觀察脂滴是否充分上染,重復染色步驟進行逐級染色,直至染色充分。

1.3.2 面積占比法的構建

面積占比法:使用Image J圖像數據分析軟件(v 1.51j)對ORO逐級染色后的顯影圖像進行處理,通過設定閾值,識別研究區域內的染色脂滴,讀取脂滴的面積占比(AF)。由于冷凍切片厚度一致,沙棘籽物料內的油脂含量(SOF),可由公式計算得到:

式中:ρsample為沙棘籽切片密度1.06 g/cm3;ρoil為沙棘籽油密度0.934 g/cm3。

精密度和準確度評價:采用索氏提取法提取沙棘籽油,提取過程中隨機取樣,制備了5個未知油含量的樣本。提取液經旋轉蒸發脫除溶劑,得到沙棘籽油,采用傳統萃取稱重法計算油含量,重復3次取平均值。對各取樣樣本進行包埋、冷凍切片、ORO逐級染色后,采用面積占比法計算得到樣本中的油含量。計算了2種方法測量結果的相對標準偏差(RSD),評價方法的重現性,并對2種方法進行了相關性分析,計算相關系數R值,評價新構建方法的準確性。

1.3.3 可視化微觀顯影超臨界CO2提取沙棘籽油的過程

稱取100 g沙棘籽粉末,與等體積玻璃珠混合,置于萃取釜,在壓力為30 MPa,溫度為45 ℃及CO2流速為5 L/h的條件下,進行超臨界CO2萃取沙棘籽油,萃取時間為5 h,每隔0.5 h對物料進行取樣,經ORO逐級染色后顯影觀察,使用面積占比法計算油含量,繪制了沙棘籽油的提取得率曲線,通過計算獲得提取速率曲線。

2 結果與分析

2.1 ORO常規染色法顯影干物料存在的問題

ORO常規染色方法顯影干物料存在的問題如圖1所示。

新鮮的沙棘籽內部的油脂通常以封閉囊泡的形式束縛于細胞中,但經干燥粉碎后的籽料是一種開放體系,脂滴以游離形式存在于微腔中,采用ORO常規染色法對其染色時,會出現一些問題。當物料中的油含量較高,所用染液的染料濃度偏低,則脂滴會發生染色不充分而呈現黃色(圖1a),后繼的洗脫步驟在洗去多余染料的同時,也會帶走少量與脂滴結合的染料。此外,如果染色時間過短,脂滴無法完全和染料融合,也可能發生染色不充分。當物料中的油含量較低時,所用的染料濃度偏高,則會導致脂滴過染(圖1b),期間如果染色時間過長,染液中的溶劑揮發,ORO染料將會發生結晶,造成染料板結現象(圖1c)。特別要指出的是,常規方法的一次性滴加染液的方式及洗脫步驟均會造成脂滴遷移(圖1d)、脂滴損失(圖1e)等現象。由此可知,ORO常規染色法很難客觀地顯影樣品中的沙棘籽油,因而無法滿足含油物料加工及提取過程中樣本監測的要求。

2.2 ORO逐級染色法的染色間隔時間優化

ORO逐級染色法是在樣本切片表面分多次滴加微量的染液,以保持物料始終處于浸潤狀態,利于染液對脂滴進行均勻上色,直至染色充分。每次滴加染液后,染料分子在微濕的微環境中擴散,再與脂滴進行結合而顯色,因而染色間隔時間對顯影的影響較大。分別采用不同染色間隔時間對籽油進行顯影,ORO逐級染色間隔時間的優化如圖2所示。當染色間隔時間為1 min時,由于染色間隔時間過短,ORO染料在切片內擴散不充分,導致脂滴不能均勻上色,并且多數脂滴未被充分染色(圖2a)。當染色間隔時間為3 min時,由于染色間隔時間過長,切片內部的溶劑逐漸揮發,染料分子向周邊擴散,脂滴呈現不規則的形態(圖2c)。最終選擇的適合的染色間隔時間為1.5 min,在此條件下沙棘籽切片中的脂滴可被充分染色而呈現、明亮的紅色(圖2b)。

2.3 ORO逐級染色法中染色級數和染液濃度的調整

ORO逐級染色沙棘籽油顯影過程如圖3所示,以相同油含量的同批次物料為例,期間調整染液濃度和染液級數,直至脂滴均勻充分上色。圖3a列中使用了1 mg/mL低質量濃度染液,在一、二級中脂滴染色不充分,第三級中脂滴充分染色,而第四級物料中脂滴已過染;圖3b列增大染液質量濃度至2 mg/mL后,在一級中脂滴染色不充分,而第三級中脂滴輕度過染,表明此條件下二級染色中脂滴充分染色;使用更高質量濃度3 mg/mL的染液進行滴染,如圖3c列所示,一、二級中脂滴已過染,由此表明使用的ORO染液濃度不宜過高,可針對不同含油量樣本調整染液濃度,少量多次的滴加染液,從而找到染色充分的級數。ORO逐級染色過程中,每一級微量的染液能被樣本吸收,能使切片始終處于半浸潤狀態,與常規染色法相比,不會有染液溢出,也無需洗脫步驟,可真實客觀地呈現干物料中的脂質分布,從而滿足了籽油提取過程中的可視化分析需求。

圖3 ORO逐級染色沙棘籽油顯影過程 (標尺100 μm)

2.4 沙棘籽油面積占比定量法的構建

ORO逐級染色法可對未知油含量樣本中的脂滴進行充分染色,并且客觀顯影其在物料中的分布,基于該方法進一步構建了定量沙棘籽油的面積占比法,并與傳統萃取質量法進行了對比評測分析。分別使用2種方法測定了5個隨機樣本中的油含量,計算了RSD,面積占比法和萃取質量法的對比評價分析如圖4所示,面積占比法的平均標準偏差約為2.49%,略低于萃取質量法的2.74%,說明面積占比法測定油脂含量的重現性更好。然后對2種方法測定結果進行了線性相關性分析,得到2組數據的相關系數高達0.998,呈現嚴格的正相關,表明新構建的面積占比法的準確性與傳統萃取質量法相當,能準確測定沙棘籽物料內部的油含量。

圖4 面積占比法和萃取質量法的對比評價分析

2.5 ORO逐級染色法對超臨界CO2提取沙棘籽油的過程分析

在壓力為30 MPa、溫度為45 ℃的條件下進行超臨界CO2萃取沙棘籽油,采用面積占比法繪制提取過程曲線(圖5),并計算了該曲線各點的斜率,得到了相應的提取速率曲線,超臨界CO2提取沙棘籽油的過程分析如圖6所示。提取曲線呈現典型的三階段過程[20]:1) 恒速提取期(CER,0～1 h);2) 減速提取期(FER,1～4 h);3) 擴散提取期(DC,4～5 h)。對各階段的物料進行取樣,經ORO逐級染色法進行染色顯影分析。圖6a表明,物料提取前沙棘籽油密集分布于微腔內,脂滴呈球形,直徑約為5 μm,SOF值接近13.1%;在CER期(圖6b),附著在籽料顆粒內表面的沙棘籽油極易被提取,SOF值迅速下降至3.61%,相應的油得率約為9.5%,約占總油脂得率的73.0%,并且油脂以恒定的速率釋放至超臨界流體中;進入FER期后,由圖6c和圖6d可知,籽料顆粒內僅有少量脂滴殘留,且脂滴直徑明顯變小,SOF值從2.77%緩慢下降至1.48%,油得率約為11.6%,油提取速率則由恒速期的100 mg/h下降至39 mg/h,該階段仍受對流傳質控制,并且顆料內的易提取油已基本提取殆盡;在DC期(圖6e),只有極少量脂滴以結合態的形式殘留于微腔內部,SOF值僅為1.48%,最終油得率為13.1%,該階段主要受擴散傳質控制,相應的油提取速率均小于30 mg/h,這一結果與Han等[21]對紅花籽油提取動力學研究相一致。通過新方法對超臨界CO2提取沙棘籽油的動態釋放過程進行了綜合分析,可用于闡明加壓流體在各個不同階段的提取作用機制,利于更精準地獲取最優的操作條件,提高原料的利用率及有效地降低提取成本。

圖5 沙棘籽油的提取過程

圖6 超臨界CO2提取沙棘籽油的過程分析(標尺100 μm)

3 結論

針對ORO常規染色法中出現的脂滴遷移、染色不充分等問題,構建了ORO逐級染色法,通過控制染料濃度及染色級數,可客觀地顯影脂滴在物料中的分布,基于此進一步構建了相應的油脂定量方法。采用新染色方法直觀分析了超臨界CO2提取沙棘籽油的CER、FER和DC三階段提取過程,可作為一種研究復雜流體提取動力學有效的輔助手段。ORO逐級染色法可有效地監測加工處理過程中籽油在物料內部的分布及遷移,實時觀測其含量變化,為籽料為油的提取理論研究及實際生產加工提供可靠的影像學參考。