谷朊抗凍多肽對面團冷凍保護作用研究

張艷艷, 郭朋磊, 王文濤, 許銘強, 張斯琦,張 華

(鄭州輕工業大學食品與生物工程學院,食品生產與安全河南省協同創新中心,河南省冷鏈食品質量安全控制重點實驗室1,鄭州 450002)

(新疆農科院農產品貯藏加工研究所2,烏魯木齊 830091)

面團是以面筋蛋白網絡為骨架,與其他組分相互作用形成的一個復雜體系[1]。面筋蛋白分為麥醇溶蛋白和麥谷蛋白,其中,麥醇溶蛋白賦予面筋黏性,麥谷蛋白賦予面筋抗延伸性,二者是影響面團流變特性和烘焙品質的主要因素[2]。因此,面筋蛋白網絡結構的變化直接決定著面團的品質。面團在冷凍過程中冰晶不斷生長,對面筋蛋白造成機械傷害,破壞了面筋蛋白分子間的相互作用力,使面筋蛋白分子結構發生改變,網絡結構被破壞,從而降低了面團的加工性能[3,4]。

控制冷凍過程中冰晶的生長和重結晶從而減緩冷凍過程對面筋蛋白網絡結構的破壞是改善面團品質的關鍵,而添加適量的冷凍保護劑來提高面筋蛋白的抗凍性是一種切實有效的方法[5]?？箖龆嚯囊蚓哂幸种票L和重結晶而保持冷凍產品品質的特點而受到廣泛關注,然而抗凍多肽的活性表達并不是整體蛋白質都在起作用,而只是與局部的特異性多肽鏈結構域有關[6-8]。因此通過酶解食源性蛋白,制備出活性明確的抗凍多肽成為新興研究熱點。

研究表明,采用堿性蛋白酶對谷朊蛋白酶解90 min得到的酶解產物具有顯著的抗凍活性和抑制冰重結晶的能力,且對冷凍面團的發酵特性和對酵母細胞具有良好的低溫保護作用,故將此種酶解產物命名為谷朊抗凍多肽[9]。為了系統地揭示谷朊抗凍多肽對冷凍面團和面筋蛋白的低溫保護機制,研究采用旋轉流動儀、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和原位拉曼光譜儀等分析手段,從流變特性、分子質量分布和蛋白結構的角度,探究谷朊抗凍多肽添加量對面團和面筋蛋白在恒溫凍藏和變溫凍藏的環境中各個組分的變化,系統地闡述谷朊抗凍多肽對面團和面筋蛋白的低溫保護機制,為其在冷凍面制品的應用提參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

谷朊粉(蛋白質質量分數85.1 g/100 g)、小麥精制粉、Alcalase蛋白酶(酶活為3.9×105U/mL,經福林法測得)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、甘氨酸(Gly)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、β-巰基乙醇、丙三醇(甘油)、考馬斯亮藍R250、考馬斯亮藍G250、二硫蘇糖醇(DTT),其他化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

HA-3480AS型和面機,Discovery HR-1型旋轉流動儀,BWS456-785S型i-Raman plus,Mini-protean型小垂直板電泳槽,Power Pac型電泳儀電源,Chemi Doc XRS+型凝膠成像儀。

1.3 實驗方法

1.3.1 谷朊抗凍多肽的制備

參考Zhang等[10,11]的方法,配制質量分數為5%的谷朊蛋白懸浮液0.5 L,恒溫攪拌5 min,同時用1 mol/L的NaOH溶液調節其pH至8.5;加入6 080 U/g的Alcalase蛋白酶,采用1 mol/L的NaOH溶液維持酶解體系pH為8.5;在酶解90 min時,將酶解液沸水浴10 min滅酶,冷卻后調節pH至7.0,于4 ℃、8 000 r/min條件下離心10 min除去沉淀;將所得上清液在4 ℃去離子水中透析除鹽(透析時間24 h)后冷凍干燥,即得谷朊抗凍多肽粉末。

1.3.2 冷凍面團的制備

參考王沛[12]的方法,取240 g小麥粉,按質量分數計,加入1%酵母、1%食鹽,谷朊抗凍多肽(0.1%、0.5%、1.0%和1.5%)和45%水(均以小麥粉質量計),和面10 min。和好的面團在30 ℃下平衡5 min,分別進行恒溫冷藏(-18 ℃下28 d)和反復凍融(8次)處理。一次凍融循環包括在-18 ℃下23 h的冷凍過程和1 h的解凍過程;凍藏面團也需在測試前解凍1 h。面團解凍均在25 ℃、80%濕度的恒溫恒濕箱中進行,未添加谷朊抗凍多肽的面團為對照樣品。

1.3.3 面筋蛋白的制備

參考王沛[12]的方法,略有修改。取300 g小麥粉,加入質量分數45%去離子水,和面10 min形成面團。面團靜置20 min形成穩定的面筋網絡結構后,在2 L去離子水中洗滌,洗滌過程中更換去離子水,直至洗滌后的去離子水不再渾濁,收集濕面筋蛋白,冷凍干燥、粉碎成粉末狀并過100目篩[13]。取1 g面筋蛋白粉末與1.5 mL去離子水在平底塑料圓盒中混合,用玻璃棒揉和成比較均勻的濕面筋蛋白(對照組)。添加質量分數分別為0.1%、0.5%、1.0%和1.5%的谷朊抗凍多肽,在4 ℃環境中靜置1 h平衡水分、穩定結構,然后轉至-18 ℃冰箱中凍藏處理(恒溫冷藏28 d和反復凍融8次)。其中,一次凍融循環為-18 ℃下冷凍23 h,25 ℃和80%相對濕度下解凍1 h。恒溫冷藏處理的樣品在測試前解凍,解凍條件同凍融處理中的解凍條件。解凍后的樣品進行冷凍干燥、研磨并過100目篩,待測。

1.3.4 動態流變特性的測定

參考Zhang等[14]的方法,略有修改。實驗參數為平板直徑20 mm,平板間距1.00 mm,應變0.5%,溫度25 ℃,頻率為0.1～40.0 Hz。

1.3.5 分子質量分布的測定

參考Wang等[15]的方法,采用質量濃度為4g/100 mL濃縮膠和12 g/100 mL的分離膠對面筋蛋白進行分析。取5 mg蛋白樣品置于1.5 mL微量離心管中,加入1 mL樣品提取液(非還原性提取液質量濃度:0.1 mol/L Tris-HCl、pH 6.8,含質量濃度2 g/100 mL SDS、10 g/100 mL甘油和0.01 g/100 mL溴酚藍;還原性提取液還含質量濃度5 g/100 mL β-巰基乙醇)。室溫萃取3 h后離心(10 000 r/min、4 ℃、10 min),上清液沸水浴5 min、冷卻后上樣。上樣量為10 μL,80 V電泳30 min,120 V穩壓電泳直至溴酚藍指示劑遷移至膠底時停止電泳。取出凝膠,用R250染色液染色1 h后,脫色數次,直至譜帶清晰,照相分析。

1.3.6 拉曼光譜采集

取一定量的面筋蛋白粉末置于i-Ramanplus光纖探頭下,采集參數:拉曼位移范圍為400～2 000 cm-1;分辨率為3 cm-1;激發波長為785 nm;積分時間為10 s;激光功率為150 mW。蛋白質結構的分析參考皮俊翔[16]的方法。

1.3.7 數據分析與處理

用Microsoft Excel 2016對實驗數據進行整理分析,用Origin 2018對數據進行作圖。通過SPSS 16.0軟件進行顯著性分析(P<0.05)。每個實驗均重復3次,取平均值,結果表示為平均值±標準差。

2 結果與討論

2.1 谷朊抗凍多肽對冷凍面團流變特性的影響

圖1顯示了分別在反復凍融和恒溫冷藏處理下面團的流變特性(G′和G″),所有面團的G′遠遠大于G″,這說明所有面團樣品的彈性都大于黏性,表現出典型的黏彈性和類固體行為,主要發生彈性形變[17,18]。此外,面團的模量值對頻率具有依賴性,隨著頻率的增大,面團的G′和G″均提高,表明在頻率掃描中面團分子間產生了強烈的交聯作用[19]。在給定頻率下,面團的G′和G″均隨著谷朊抗凍多肽添加量的增加而逐漸下降,這是由于冰晶生長和重結晶導致面團中的面筋蛋白發生解聚,從而引起面團的網絡結構遭到破壞[20,21]。其中,質量分數0.1%谷朊抗凍多肽的添加能夠減緩冷凍處理對面團流變特性的破壞;此外,質量分數0.5%的谷朊抗凍多肽質量分數對面團流變特性也具有較好的保護作用。添加谷朊抗凍多肽使面團黏彈性下降的原因是谷朊抗凍多肽的存在降低了面團冷凍過程中的干耗,而高水分含量會引起面團體系更容易發生形變,表現為黏彈性的降低[22]。

注:G′為彈性模量;G″為黏性模量。對照-FT、0.1%-FT、0.5%-FT、1.0%-FT和1.5%-FT分別指反復凍融處理下含質量分數0.0%、0.1%、0.5%、1.0%和1.5%谷朊抗凍多肽的面團;對照-FS、0.1%-FS、0.5%-FS、1.0%-FS和1.5%-FS分別指恒溫冷藏處理下含質量分數0.0%、0.1%、0.5%、1.0%和1.5%谷朊抗凍多肽的面團。

2.2 谷朊抗凍多肽對冷凍面筋蛋白分子質量分布的影響

采用SDS-PAGE測定面筋蛋白的分子質量分布,結果如圖2所示。與面筋蛋白的非還原性SDS-PAGE電泳圖相比,還原性電泳圖中在65～100 ku和40～45 ku范圍內明顯出現一些條帶。根據面筋蛋白中的亞基大小,可知65～100 ku內條帶為高分子質量麥谷蛋白亞基(HMW-GS),而40～45 ku內條帶為低分子質量麥谷蛋白亞基(LMW-GS),由谷蛋白大分子聚合物(GMP,分子質量較大、處于電泳凝膠頂部)在強還原劑β-巰基乙醇的作用下解聚而成[23]。凍藏處理會破壞面筋蛋白中化學作用力,使蛋白結構舒展、弱化,更容易與SDS結合[10],從而使電泳圖中一些條帶顏色加深。

注:a1、a2和a3分別指未凍藏、反復凍融和恒溫冷藏處理面筋蛋白的非還原性電泳圖;b1、b2和b3分別指未凍藏、反復凍融和恒溫冷藏處理面筋蛋白的還原性電泳圖;泳道M、1、2、3、4、5分別為maker、未添加和添加質量分數為0.1%、0.5%、1.0%、1.5%谷朊抗凍多肽的面筋蛋白。

在還原性電泳圖中,未冷凍的面筋蛋白樣品之間沒有明顯差異,說明不同添加量的谷朊抗凍多肽不會影響面筋蛋白亞基的變化。而在反復凍融處理下,與未添加谷朊抗凍多肽的面筋蛋白相比,添加谷朊抗凍多肽的面筋蛋白中HMW-GS和LMW-GS條帶變淺,其中質量分數為0.1%和0.5%時條帶最淺,說明谷朊抗凍多肽可以抑制反復凍融過程中GMP的解聚。此外,在恒溫冷藏處理下,隨著谷朊抗凍多肽添加量的增加,面筋蛋白中LMW-GS條帶先變淺后變深,谷朊抗凍多肽質量分數為0.5%時LMW-GS條帶最淺,說明谷朊抗凍多肽在此水平下對面筋蛋白的冷凍保護作用最好,可以降低凍藏處理對面筋蛋白結構的破壞。而谷朊抗凍多肽質量分數為1.0%～1.5%時,可能引入了較多的短肽和氨基酸,反而不利于凍藏過程中面筋蛋白的結構[24]。

2.3 谷朊抗凍多肽對冷凍面筋蛋白分子結構的影響

拉曼光譜常用來表征蛋白分子結構的變化,其中500～550 cm-1、760 cm-1與820～860 cm-1和1 600～1 700 cm-1分別表征面筋蛋白中二硫鍵、色氨酸、酪氨酸以及酰胺Ⅰ帶[25]。

2.3.1 二級結構

谷朊抗凍多肽添加量對面筋蛋白的影響結果如圖3所示。從圖3a可以看出,未冷凍面筋蛋白中二級結構以α-螺旋為主,質量分數為57%。對照組中α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規則卷曲的質量分數分別為57.2%、12.7%、10.3%和19.3%。在反復凍融處理后(圖3b)的對照組中α-螺旋的質量分數從57.2%下降到55.1%,而無規則卷曲和β-轉角相對含量提高;經恒溫冷藏處理后(圖3c)的對照組中α-螺旋和無規則卷曲相對含量出現一樣的變化趨勢,β-折疊和β-轉角相對含量沒有出現明顯變化。結果表明,凍藏處理使面筋蛋白的二級結構發生了變化,α-螺旋結構的相對含量下降,蛋白分子結構向β-轉角和無規則卷曲轉變。這與宋國勝等[26]的報道一致,這種變化主要是由于凍藏過程出現冰晶生長和重結晶,此過程會破壞蛋白分子內維持α-螺旋的氫鍵,使螺旋結構被破壞,蛋白分子重排以保持相對穩定狀態。

圖3 谷朊抗凍多肽對面筋蛋白二級結構的影響

在反復凍融處理樣品中,隨著谷朊抗凍多肽添加量的增加,面筋蛋白中α-螺旋相對含量均先提高后下降,無規則卷曲相對含量先下降后升高。當質量分數為0.5%時,面筋蛋白中α-螺旋相對含量最高。在恒溫冷藏處理樣品中,谷朊抗凍多肽添加量對面筋蛋白二級結構的影響也存在相同的變化規律。結果表明,面筋蛋白在凍藏過程中添加一定比例的谷朊抗凍多肽可以抑制冷凍過程中冰晶的生長、降低冷凍對蛋白網絡結構的破壞。此外,谷朊抗凍多肽質量分數為0.5%時,其對面筋蛋白的冷凍保護作用最顯著,添加量更高反而其冷凍保護作用下降,這可能是因為谷朊抗凍多肽的添加量較高時,引入了較多不利于面筋蛋白結構穩定的短肽和氨基酸[24]。

2.3.2 氨基酸側鏈

蛋白拉曼光譜中850 cm-1與830 cm-1附近的特征峰隨著微環境變化而改變,兩峰的相對強度(I850/I830)反映著酚羥基氫鍵的相關信息,被廣泛用來表征酪氨酸殘基的包埋和暴露的程度[27]。當I850/I830>1時,酪氨酸殘基趨向于“暴露”態;當I850/I830<1時,酪氨酸殘基趨向于“包埋”態。面筋蛋白在凍藏處理后,I850/I830值均有所提高,由“包埋”態趨向于“暴露”態。該結果與李銀麗[28]的報道一致,說明冷凍處理破壞了面筋蛋白中的氫鍵,使面筋蛋白的三級結構受到破壞,酪氨酸殘基暴露到蛋白分子的表面。在反復凍融處理下,隨著谷朊抗凍多肽添加量的增加,面筋蛋白的I850/I830值先降低后升高,在谷朊抗凍多肽質量分數為0.5%時,I850/I830值最小。此外,恒溫冷藏處理下I850/I830出現一樣的變化趨勢。

拉曼光譜中760 cm-1附近的譜峰歸屬為色氨酸殘基的伸縮振動,峰強度可以反映色氨酸微環境極性的變化。色氨酸殘基的暴露表現為I760的降低,而I760的提高則表明色氨酸殘基掩埋性的增加[29]。由圖4可見,未添加谷朊抗凍多肽的面筋蛋白在凍藏處理后,峰強度I760下降,表明色氨酸殘基由相對“包埋”態轉變為相對“暴露”態。在反復凍融和恒溫冷藏處理下,I760均隨谷朊抗凍多肽添加量的增加先提高后降低,質量分數為0.5%時I760值最大。結合酪氨酸殘基微環境(I850/I830)的變化結果,表明谷朊抗凍多肽可以抑制凍藏處理對蛋白三級結構的破壞,從而使面筋蛋白拉曼光譜中I850/I830值下降、I760值提高。在質量分數為0.5%時,谷朊抗凍多肽對面筋蛋白的冷凍保護作用最顯著。

圖4 谷朊抗凍多肽對面筋蛋白氨基酸側鏈的影響

2.3.3 二硫鍵構型

面筋蛋白拉曼光譜中500～550 cm-1是二硫鍵伸縮振動的特征頻率,拉曼特征峰的結構可歸屬為:500～510 cm-1處峰歸屬為扭式-扭式-扭式(g-g-g)構型,515～525 cm-1處峰歸屬為扭式-扭式-反式(g-g-t)構型,535～545 cm-1處峰歸屬為反式-扭式-反式(t-g-t)構型。其中,g-g-g構型是分子內二硫鍵構型、最穩定,g-g-t構型次之,t-g-t構型是分子間二硫鍵構型、穩定性最差[25]。

圖5a顯示了未冷凍面筋蛋白中二硫鍵構型的相對含量。對照組中二硫鍵g-g-g、g-g-t和t-g-t構型的質量分數分別為33.4%、40.3%和26.3%。反復凍融處理后(圖5b),二硫鍵g-g-t構型的相對含量下降,而g-g-g和t-g-t構型含量提高。恒溫冷藏處理使面筋蛋白中二硫鍵g-g-g和g-g-t構型含量出現一樣的變化趨勢,t-g-t構型含量沒有明顯變化(圖5c)。這表明凍藏處理破壞了面筋蛋白分子內二硫鍵,導致面筋蛋白中二硫鍵g-g-g構型相對含量的下降。從圖5b和圖5c可以看出,添加一定比例(質量分數0.1%和0.5%)的谷朊抗凍多肽可以抑制反復凍融和恒溫冷藏處理對面筋蛋白中二硫鍵的破壞,從而維持了面筋蛋白中二硫鍵g-g-g構型。這是由于谷朊抗凍多肽具有抗凍活性,抑制了凍藏過程中冰晶的生長和重結晶,降低了冰重結晶對面筋蛋白結構的破壞[30]。

圖5 谷朊抗凍多肽對面筋蛋白中二硫鍵構型的影響

3 結論

系統地闡述了谷朊抗凍多肽對面團和面筋蛋白的冷凍保護機制,流變特性表明經過冷凍處理的面團彈性模量大于黏性模量,當谷朊抗凍多肽質量分數為0.5%時,可以有效地抑制凍藏處理下面團中自由水的形成,在此條件下LMW-GS條帶最淺,表明谷朊抗凍多肽在此條件下對面筋蛋白的冷凍保護作用最好。谷朊抗凍多肽的添加有效抑制了冷凍過程中冰晶生長對面團和面筋蛋白網絡結構的破壞,保護了面筋網絡結構的完整性,維持了面筋蛋白在面團中的骨架作用。