銅綠假單胞菌中黃曲霉毒素B1降解酶的純化及其降解產(chǎn)物解析

許艷華, 董慧燕, 婁海偉, 王香玉, 趙仁勇

(河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院,鄭州 450001)

黃曲霉毒素是由黃曲霉和寄生曲霉等真菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物,是一類二呋喃香豆素衍生物的類似物質(zhì)[1]。已報(bào)道的黃曲霉毒素有20種,常見的有4種:黃曲霉毒素B1(Aflatoxin B1,AFB1)、B2(AFB2)、G1(AFG1)和G2(AFG2)[2]。其中,AFB1的毒性最強(qiáng),具有很強(qiáng)的致突變性和致癌性,被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(International Agency for Research on Cancer, IARC)列為一級致癌物[3]。糧食和飼料極易受黃曲霉毒素的污染,對人畜健康造成了極大的威脅,因此黃曲霉毒素的脫毒研究受到學(xué)者的廣泛關(guān)注[4]。

目前,黃曲霉毒素的脫毒方法主要分為物理、化學(xué)和生物法。物理法主要包括加熱、吸附和紫外照射等,化學(xué)法有堿處理和氧化劑處理[5-7]。這些方法可以單一使用,也可以互為補(bǔ)充達(dá)到更好的降解效果。但是物理和化學(xué)法存在解吸附作用和化學(xué)試劑殘留等問題,對食品營養(yǎng)、感官品質(zhì)和風(fēng)味有極大影響[8,9],而生物降解法由于條件溫和,且具有特異性的優(yōu)勢逐漸成為研究熱點(diǎn)[10]。生物法降解黃曲霉毒素主要有2種途徑,包括菌體吸附和酶的降解作用[11]。Peltonen等[12]選取20株乳酸菌和雙歧桿菌降解AFB1,72 h后發(fā)現(xiàn)有2株乳桿菌和1株鼠李糖乳桿菌可以去除50%以上的AFB1,但是通過反復(fù)水洗后結(jié)合的AFB1會(huì)再次被釋放。菌體吸附AFB1的這種可逆性限制了其在生產(chǎn)中的廣泛應(yīng)用。在微生物酶降解AFB1方面,已報(bào)道的黃曲霉毒素降解酶有漆酶[13,14]、過氧化物酶[15, 16]、氧化酶[17]和還原酶[18]等。其中,漆酶主要由真菌產(chǎn)生,例如云芝(Trametesversicolor)、黑曲霉(Aspergillusniger)和平菇(Pleurotusostreatus)等,前兩株真菌所產(chǎn)漆酶對AFB1的降解率分別為87%和55%[19];其中黑曲霉能夠?qū)FB1轉(zhuǎn)化為黃曲霉毒醇[20]。Yehia等[21]從平菇的培養(yǎng)濾液中分離到一種分子質(zhì)量約為42 ku的錳過氧化物酶,該酶與AFB1反應(yīng)24 h后,對AFB1的降解率可達(dá)67%。由鼠耳芥(Phanerochaetesordida)分泌的錳過氧化物酶能先將AFB1氧化為AFB1-8,9-環(huán)氧化物,隨后水解為AFB1-8,9-二氫二醇[22]。也有許多學(xué)者對降解黃曲霉毒素的細(xì)菌進(jìn)行研究,Taylor等[18]從分枝桿菌中分離并鑒定出降解黃曲霉毒素的F420H2-依賴性還原酶,通過輔因子F420H2還原不飽和酯進(jìn)而激發(fā)毒素分子的水解。

基于本實(shí)驗(yàn)室前期篩選到一株能產(chǎn)生高溫下降解AFB1降解菌株——銅綠假單胞菌M4(Pseudomonasaeruginosa)[23],研究進(jìn)一步利用超濾、離子交換色譜和凝膠過濾色譜等分離手段對該菌株產(chǎn)生的降解酶進(jìn)行純化,最終得到能夠高效降解AFB1的小分子多肽。利用薄層色譜(Thin Layer Chromatography, TLC)和超高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(Ultra-high Performance Liquid Chromatography-Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometry,UPLC-Q-TOFMS)對AFB1的降解產(chǎn)物進(jìn)行鑒定,并推測其降解機(jī)理,為生物法降解AFB1提供材料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

銅綠假單胞菌M4菌株,本實(shí)驗(yàn)室保存。

AFB1標(biāo)準(zhǔn)品(純度>98%);甲酸、乙腈均為質(zhì)譜級;二硫蘇糖酰醇、碘乙胺、蛋白酶K均為分析純;甲醇為色譜級;Sephadex G-50凝膠;薄層層析硅膠板G。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基:蛋白胨10.0 g,牛肉膏3.0 g,NaCl 5.0 g,蒸餾水1 L,pH 7.0,121 ℃高壓滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基:蛋白胨10.0 g,牛肉膏3.0 g,葡萄糖2.0 g,NaCl 8.5 g,KH2PO41.0 g,蒸餾水1 L,pH 7.0,121 ℃高壓滅菌20 min[24]。

1.3 儀器與設(shè)備

HiPrePTMDEAE FF型離子交換柱,3 ku超濾離心管,5810R型高速冷凍離心機(jī),Concentrator plus型真空離心濃縮儀,ZHWY-111B型恒溫培養(yǎng)振蕩器,ZHJH-C1109C型超凈工作臺(tái),YXQ-LS型立式壓力蒸氣滅菌器,Freezone型冷凍干燥機(jī),e2695型高效液相色譜儀,2489型制備液相色譜儀,BioLogicDuoFlow層析系統(tǒng),Ultimate3000型超高效液相色譜-電噴霧-離子肼串聯(lián)質(zhì)譜,高效液相串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 AFB1的提取及檢測

AFB1的提取及檢測參照GB 5009.22—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定》第三法高效液相色譜-柱后衍生法。經(jīng)免疫親和柱凈化后在50 ℃條件下用氮?dú)獯蹈?用1 mL流動(dòng)相復(fù)溶,經(jīng)0.22 μm無菌濾膜過濾后用高效液相色譜儀檢測AFB1。高效液相分析柱為C18(250 mm×4.6 mm,5 μm),流動(dòng)相為甲醇水溶液(甲醇∶水的體積比=45∶55),流速為0.8 mL/min,運(yùn)行時(shí)間為25 min,柱溫為30 ℃,熒光檢測器的激發(fā)波長λex=360 nm,發(fā)射波長λem=440 nm。AFB1降解率計(jì)算公式為:

式中:X1為空白對照組中AFB1質(zhì)量/ng;X2為樣品組中殘留AFB1質(zhì)量/ng;Y為降解率/%。

1.4.2 AFB1降解酶的分離純化

1.4.2.1 超濾分離

將菌株接種于種子培養(yǎng)基中,37 ℃、160 r/min條件下活化培養(yǎng)24 h,然后以體積分?jǐn)?shù)5%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中,于相同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)48 h得到發(fā)酵液;將發(fā)酵液在4 ℃、8 000 r/min條件下離心10 min,去除菌體得到上清液。在截留分子質(zhì)量為3 ku的超濾管內(nèi)于4 ℃、6 000 r/min條件下離心60 min,得到濾上溶液(>3 ku)與濾下溶液(<3 ku)。

1.4.2.2 凝膠過濾層析分離

將溶脹好的Sephadex G-50葡聚糖凝膠倒入1.5 cm×80 cm的層析柱中,用20 mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH 7.4)進(jìn)行預(yù)平衡。將超濾得到的濾下溶液用0.22 μm濾膜過濾,然后注入到Sephadex G-50色譜柱中,用20 mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH 7.4)進(jìn)行洗脫,流速為0.5 mL/min。利用2489型制備液相系統(tǒng)在紫外波長214 nm下檢測吸收峰,收集各洗脫峰并測定其降解特性。前期預(yù)實(shí)驗(yàn)得知其粗酶是耐高溫的降解酶,高溫處理?xiàng)l件為121 ℃,30 min。

1.4.2.3 離子交換層析分離

在對凝膠過濾色譜分離的各洗脫峰進(jìn)行檢測后,使用BioLogicDuoFlow層析系統(tǒng)將具有高降解活性的組分進(jìn)一步純化。用20 mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH7.4)進(jìn)行預(yù)平衡,將經(jīng)凝膠過濾層析純化后的溶液注入到HiPrePTMDEAE FF型離子交換柱(1.6 cm×10 cm)中,用20 mmol/L磷酸鈉緩沖液(含1 mol/L NaCl,pH 7.4)對樣品進(jìn)行梯度洗脫,流速為0.6mL/min,在214 nm紫外波長下檢測洗脫峰,收集后測定各個(gè)洗脫峰的降解特性。

1.4.3 酶活力測定

參照武瑞霞等[25]對酶活力的定義并稍微修改,在37 ℃、pH 7.4條件下,反應(yīng)72 h降解1 ng AFB1所需要的酶量定義為1個(gè)酶活單位(U)。

1.4.4 蛋白濃度測定

參照高英等[26]的方法進(jìn)行測定。

1.4.5 峰5組分多肽鑒定

1.4.5.1 還原烷基化

用純水將樣品溶解,加入10 mmol/L的二硫蘇糖醇溶液,于56 ℃水浴中還原1 h。加入50 mmol/L的碘乙酰胺溶液,避光反應(yīng)40 min。使用脫鹽柱對樣品脫鹽,然后在45 ℃真空離心濃縮儀中揮發(fā)干溶劑。

1.4.5.2 多肽檢測

用0.1%的甲酸水溶液將還原烷基化的樣品復(fù)溶,注入到超高效液相色譜-電噴霧-離子肼串聯(lián)質(zhì)譜儀(Ultra-high Performance Liquid Chromatography with Electrospray Ionization tandem Mass Spectrometry,UPLC-ESI-MS/MS)中進(jìn)行檢測,使用Maxquant(1.6.2.10)軟件檢索目標(biāo)蛋白數(shù)據(jù)庫。超高效液相色譜檢測柱為C18(150 μm×150 mm,5 μm),流動(dòng)相為A(0.1%甲酸水溶液)和B(含0.1%甲酸的乙腈溶液),線性梯度洗脫條件為0～5 min 6%～9%B,5～20 min 9%～14%B,20～50min 14%～30%B,50～58 min 30%～40%B,58～60 min 40%～95%B,流速為6×10-4mL/min,運(yùn)行時(shí)間60 min。

質(zhì)譜的操作參數(shù)為噴霧電壓2 200 V,毛細(xì)管溫度270 ℃,掃描范圍400.0～6 000.0m/z,裂解模式為碰撞誘導(dǎo)解離,在正離子模式下分析。在依賴數(shù)據(jù)的掃描模式下收集高質(zhì)量的碎片數(shù)據(jù)。通過全掃描分析獲得原始圖譜數(shù)據(jù),并使用Xcalibur3.0(Thermo Fisher Scientific)進(jìn)行分析。

1.4.6 AFB1降解產(chǎn)物的檢測

1.4.6.1 薄層色譜法

用20 mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH 7.4)將待測組分復(fù)溶,取975 μL并加入25 μL AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液(20 μg/mL)混勻,使AFB1終質(zhì)量濃度為500 ng/mL,于37 ℃、160 r/min條件下避光反應(yīng)72 h,以無菌發(fā)酵培養(yǎng)基與AFB1在相同條件下反應(yīng)后的溶液作為空白組,參照邵帥等[27]使用的薄層色譜法觀察AFB1的降解情況。

1.4.6.2 高效液相色譜法

將待測組分與AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 μg/mL)混合,使AFB1終質(zhì)量濃度為2.5 μg/mL,于37℃、160 r/min條件下分別避光反應(yīng)0、6、24和72 h。以反應(yīng)0 h的混合液為空白對照,利用e2695型高效液相色譜儀分離降解產(chǎn)物。液相分離條件為:流動(dòng)相為甲醇水溶液(甲醇∶水的體積比=70∶30);流速0.3mL/min;柱溫30℃;紫外檢測器的波長為213 nm。

1.4.6.3 UPLC-Q-TOF MS質(zhì)譜法

如1.4.6.2所示方法制備0 h和72 h樣液,用等體積的氯仿萃取3次,合并有機(jī)相,氮吹后用流動(dòng)相(甲醇∶水的體積比=70∶30)復(fù)溶,經(jīng)0.22 μm無菌濾膜過濾后,利用UPLC-Q-TOF MS對AFB1降解產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。超高效液相分離條件同1.4.6.2中e2695型高效液相檢測條件。

在裝有電噴霧離子源的Q-TOF系統(tǒng)上以正離子模式進(jìn)行質(zhì)譜分析。最佳條件設(shè)置為毛細(xì)管電壓2 800 V,錐孔電壓20 V,裂解電壓3 V,離子源溫度80 ℃,脫溶劑化溫度180 ℃。錐孔和脫溶劑化氣體流速分別為80 L/h和400 L/h。數(shù)據(jù)收集范圍為100～1 000m/z。

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 20.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析;采用Origin 8.5軟件進(jìn)行繪圖,使用Xcalibur3.0軟件對UPLC-ESI-MS/MS圖譜分析;采用Massynlynx v4.1對UPLC-Q-TOF MS結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 AFB1降解酶的分離純化

2.1.1 凝膠過濾層析色譜

使用3 ku超濾管將銅綠假單胞菌M4菌株的發(fā)酵上清液離心,得到濾上(29 U/mg)和濾下(218U/mg)兩部分溶液(數(shù)據(jù)未列出),選用比活性較高的濾下液(<3 ku)進(jìn)行Sephadex G-50凝膠過濾層析分離,在120～420 min時(shí)間內(nèi)得到2個(gè)明顯的洗脫峰,將其命名為組分1和組分2。2個(gè)組分對AFB1的降解特性如圖1顯示,組分1和組分2對AFB1的降解率分別為9.48%和22.02%。加熱處理前后,組分1對AFB1的降解率無顯著差異(P<0.05);而加熱處理后的組分2對AFB1的降解率為66.15%,比熱處理前增加了2倍。在類似的研究中,有學(xué)者篩選到降解AFB1的沙克氏桿菌(Bacillusshackletonii)L7,其上清液經(jīng)超濾濃縮并加熱處理后降解率由70.12%增加至76.67%。經(jīng)蛋白酶K處理后,2個(gè)組分的降解率均顯著下降(P<0.05),因蛋白酶K可破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)而影響蛋白酶的活性[29],結(jié)合實(shí)驗(yàn)室前期實(shí)驗(yàn)可以推測2個(gè)組分中的降解活性物質(zhì)均為耐高溫蛋白類。因組分2對AFB1具有較好的降解效果,所以進(jìn)一步對組分2進(jìn)行純化。

注:圖中不同字母之間表示差異顯著(P<0.05),下同。

2.1.2 離子交換色譜

凝膠過濾層析得到的組分2進(jìn)一步經(jīng)離子交換層析分離得到5個(gè)組分,分別命名為峰1、峰2、峰3、峰4和峰5(圖2a)。由圖2b可知,未處理的5個(gè)組分對AFB1的降解率范圍為10.99%～17.08%,經(jīng)加熱處理后,峰5組分對AFB1的降解率增加了1.88倍。除峰1組分外,蛋白酶K處理后的其他組分對AFB1的降解活性均顯著下降(P<0.05)。發(fā)酵上清液純化過程中的蛋白濃度及比活性見表1,峰5組分比活性為2 298.49 U/mg,回收率為10.57%,表明純化效果良好。進(jìn)一步對峰5組分進(jìn)行多肽鑒定。

表1 發(fā)酵上清液分離純化過程中的蛋白濃度及比活性

注:圖a為組分2的離子交換色譜圖,1～5為峰號。圖b為離子交換色譜各洗脫峰對AFB1的降解特性對比。

2.2 峰5組分多肽鑒定

采用Xcalibur.3.0軟件對UPLC-ESI-MS/MS質(zhì)譜圖進(jìn)行分析,從總離子流圖可知峰5組分是多肽混合物(圖3)。多肽經(jīng)碰撞誘導(dǎo)解離時(shí)的破裂作用優(yōu)先發(fā)生在肽鍵上,生成專一的序列離子,根據(jù)碎片斷裂情況可解析得到多肽序列[30](圖4)。采用MaxQuant(1.6.2.10)軟件對UPLC-ESI-MS/MS原始文件進(jìn)行分析,并根據(jù)樣品的種類在目標(biāo)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行搜索,在峰5組分中檢測出6個(gè)主要肽段,其所帶電荷量不同,分子質(zhì)量范圍為646.38～1 715.96 u(表2)。目前,在多肽對黃曲霉毒素脫毒的相關(guān)研究中,有學(xué)者利用凝膠過濾色譜及高效液相色譜從巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)CGMCC7089的發(fā)酵液中分離得到3種抑制黃曲霉生長和產(chǎn)毒的活性多肽[31]。

圖3 峰5組分總離子流色譜圖

注:a是肽段FIDLKNQQARIKDK的二級質(zhì)譜圖,b是肽段DLFLEKIKREGNRV的二級質(zhì)譜圖。

2.3 峰5降解AFB1的產(chǎn)物分析

2.3.1 薄層色譜法檢測AFB1降解產(chǎn)物

AFB1是熒光化合物,在紫外燈下能發(fā)出藍(lán)色熒光[32],采用薄層色譜法可以方便快捷的對AFB1的降解情況進(jìn)行初步判斷。Lee等[33]曾報(bào)道內(nèi)酯環(huán)的破壞會(huì)導(dǎo)致AFB1熒光特性的消失,而改變環(huán)戊烯酮環(huán)、呋喃環(huán)及內(nèi)酯環(huán)上取代基則不會(huì)影響熒光特性;也有學(xué)者報(bào)道過具有熒光特性的AFB1降解產(chǎn)物[27,34]。將自然晾干的硅膠板置于365 nm紫外燈下照射,結(jié)果見圖5。硅膠板上0 h樣品的AFB1有明顯的藍(lán)色熒光斑點(diǎn),降解72 h后樣品熒光強(qiáng)度明顯減弱,且在硅膠板上出現(xiàn)了新的熒光斑點(diǎn),這說明AFB1可能被降解成了新的具有熒光特性的物質(zhì)。因此推測很可能是AFB1的內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)受到了部分破壞。

圖5 AFB1降解產(chǎn)物的薄層色譜圖

2.3.2 高效液相法檢測AFB1降解產(chǎn)物

多肽降解AFB1的高效液相色譜結(jié)果見圖6,AFB1標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間為13.05 min,且隨著降解時(shí)間的延長,其響應(yīng)值和峰面積均呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢,表明AFB1被降解。由薄層色譜結(jié)果可知,產(chǎn)物的遷移率小于AFB1,極性比AFB1強(qiáng),降解產(chǎn)物的保留時(shí)間應(yīng)比AFB1短。與0 h相比,在保留時(shí)間4.73 min時(shí)出現(xiàn)了新的物質(zhì)P,并且隨著降解時(shí)間的延長響應(yīng)值不斷變大,該物質(zhì)P有可能是AFB1降解產(chǎn)物。

2.3.3 降解產(chǎn)物的質(zhì)譜分析

為進(jìn)一步確定降解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)式,利用UPLC-Q-TOF MS圖譜和相關(guān)的文獻(xiàn)進(jìn)行分析。用軟件Xcalibur v.3.0扣除0 h的背景影響,在72 h降解液中檢測到一個(gè)主要的產(chǎn)物峰P,其二級質(zhì)譜圖(圖7)顯示產(chǎn)物P的質(zhì)荷比為206.058 9,利用Massynlynx v4.1軟件進(jìn)行分析,其分子式為C11H10O4。圖8推測出產(chǎn)物P可能的3種結(jié)構(gòu)式及相應(yīng)的裂解途徑,根據(jù)薄層色譜已知AFB1產(chǎn)物具有熒光特性,所以AFB1的降解產(chǎn)物最可能是圖8a。如圖9所示,在多肽的作用下,AFB1的結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化,呋喃環(huán)上的8、9位雙鍵被破壞,苯環(huán)上的甲氧基團(tuán)和環(huán)戊烯酮發(fā)生斷裂,這些結(jié)構(gòu)的變化使降解產(chǎn)物毒性降低,或無毒[33]。在類似的研究中,Samuel等[35]利用薄層色譜、氣質(zhì)聯(lián)用和近紅外光譜等方法從惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)MTCC 1274和2445兩株菌對AFB1的降解液中檢測并推測出AFB1的降解產(chǎn)物為AFD1(質(zhì)荷比:286)、AFD2(質(zhì)荷比:206)和AFD3(質(zhì)荷比:149)。Eshelli等[36]對紅球菌降解AFB1的產(chǎn)物碎裂方式進(jìn)行推測,發(fā)現(xiàn)AFB1經(jīng)內(nèi)酯環(huán)水解、脫羧反應(yīng)得到了AFD1和AFD2這2種中間產(chǎn)物。

圖7 AFB1降解產(chǎn)物P的二級質(zhì)譜圖

圖8 AFB1降解產(chǎn)物P可能的裂解途徑

圖9 推測AFB1可能的降解途徑

3 結(jié)論

利用超濾、凝膠滲透色譜及離子交換色譜等方法從銅綠假單胞菌M4發(fā)酵上清液中分離到了新的降解AFB1的小分子多肽,經(jīng)加熱處理后,其對AFB1的降解率增加了1.17倍。根據(jù)薄層色譜結(jié)果所示,有新的降解產(chǎn)物出現(xiàn)。利用UPLC-Q-TOF MS圖譜及Massynlynx v4.1系統(tǒng)分析,降解產(chǎn)物P的分子式為C11H10O4,推測多肽破壞了AFB1的主要毒性位點(diǎn),降解產(chǎn)物P的毒性可能遠(yuǎn)低于AFB1,或無毒。在進(jìn)一步的研究中,應(yīng)考慮通過合成或克隆表達(dá)的手段得到大量的多肽,并通過核磁手段驗(yàn)證產(chǎn)物結(jié)構(gòu),為該多肽的實(shí)際工業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。