基于網絡藥理學探究石斛堿治療阿爾茲海默病的關鍵靶點

洪夢杰，于白音，劉洋洋，陳 娟，陳 潔

（1.河南科技職業大學 醫學院，河南 周口 466000；2.韶關學院 廣東省粵北食藥資源利用與保護重點實驗室，廣東 韶關 512005；3.興安盟食品藥品檢驗檢測中心，內蒙古 烏蘭浩特 137400）

阿爾茲海默病（Alzheimer’s disease，簡稱AD）是發病于老年人群的一種常見的神經退行性疾病，衰老和淀粉樣蛋白-β（Aβ）聚集等因素與AD 的發病密切相關［1-2］. AD 嚴重影響病患的生活質量，是造成患者死亡的主要風險因素［3］. 隨著人口老齡化程度的加深，AD 病患人數將進一步增加. 金釵石斛（Dendrobium nobileLindl.）別名金釵石、扁金釵、扁黃草、扁草等，為蘭科石斛屬多年生附生草本植物，是中藥石斛的基源植物之一［4］. 其主要活性成分有生物堿類、酚類、多糖類、黃酮類、萜類等［5-7］. 生物堿類化合物是最早從石斛屬植物中分離到的化合物，是石斛中重要的活性成分［8-10］. 中華人民共和國藥典（2020 年版）將石斛堿（Dendrobine）作為金釵石斛的指標性成分［11］. 現代藥理研究表明，石斛堿具有神經保護［12-13］、抗氧化［14-15］、抗炎［16］和抗腫瘤［17］等功效，這些功效對治療AD 有著積極的意義，但石斛堿治療AD 的作用機理及分子機制尚未得到系統闡釋，還需進一步探究［18-20］.

網絡藥理學是基于人工智能和大數據的一個藥物系統研究的新興交叉前沿學科，它是基于系統生物學理論，用生物信息學和網絡分析方法，通過構建特定藥物的“藥物-靶點-疾病（治療通路）”之間的網絡預測模型，預測藥物作用靶點，分析藥物的作用機制，為中藥復雜體系研究提供了新思路，可對石斛堿治療AD 的作用機理進行系統的預測分析［21］. 為此，筆者借助網絡藥理學方法，初步探尋石斛堿治療AD 的關鍵靶點和通路，為石斛堿的進一步開發和利用提供依據.

1 材料與方法

1.1 石斛堿治療AD 潛在靶點的獲取

將Dendrobine 輸入PubChem 數據庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）進行檢索，獲得石斛堿SMILES化學式，然后將該化學式上傳到Swiss Target Prediction 數據庫（http://www.swisstargetprediction.ch/），設置屬性為homo sapiens（人類），收集石斛堿靶點；在GeneCards 數據庫（https://www.genecards.org/）中，以“Alzheimer’s disease”為關鍵詞搜索，篩選Relevance score＞1 的基因，獲得AD 靶點；將收集的石斛堿靶點和AD 靶點導入在線分析工具Venny 2.1.0（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/），獲取石斛堿與AD的共同靶點，并繪制韋恩圖，以獲得石斛堿治療AD 的潛在靶點.

1.2 石斛堿-AD 靶點蛋白互作（Protein-protein interaction，PPI）網絡構建

將石斛堿與AD 的共同靶點上傳至STRING 11.5 數據庫（https://cn.string-db.org/），限定物種為“homo sapiens”，設置最低相互作用閾值的中等置信度（＞0.4），其余參數為默認，得到PPI 數據，將數據導入Cytoscape 3.9.1，運用CytoNCA 插件［22］對網絡進行拓撲分析，計算度中心性（Degree，DC）、介數中心性（Betweenness，BC）和接近中心性（Closeness，CC），篩選出同時滿足大于DC、BC 和CC 中位數的靶點，即為核心靶點，構建核心靶點的PPI 網絡［23-24］.

1.3 核心靶點的GO 功能注釋和KEGG 通路富集分析

將篩選出的核心靶點上傳至DAVID 數據庫（https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp），進行基因本體（Gene ontology，GO）功能注釋、京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析，以P<0.05 為篩選條件. 獲得生物過程（Biological process，BP）、細胞成分（Cellular component，Cc）、分子功能（Molecular function，MF）和KEGG 關鍵信號通路的富集信息，并在微生信網站（https://www.bioinformatics.com.cn/）對結果進行可視化分析.

1.4 “石斛堿-核心靶點-通路”網絡圖的構建

將石斛堿、通路及其相關靶點導入Cytoscape 3.9.1 軟件，得到“石斛堿-核心靶點-通路”網絡圖. 利用插件CytoNCA 對網絡中成分節點進行拓撲分析，反向篩選石斛堿治療AD 的關鍵靶點.

2 結果與分析

2.1 石斛堿-AD 靶點PPI 網絡構建

經收集篩選共獲得石斛堿靶點139 個，AD疾病靶點9 691 個，共有靶點125 個. 將共有靶點上傳至STRING 11.5 數據庫，構建PPI 網絡圖，共篩選出115 個靶點參與PPI 網絡，將數據導入Cytoscape 3.9.1 軟件，利用CytoNCA 插件對網絡節點進行拓撲分析，篩選出24 個同時滿足大于DC、BC 和CC 中位數的靶點，見圖1.圖1 可以直觀地表明蛋白與蛋白的相互作用，線條越多表明與之相關的蛋白越多，蛋白之間的連線越粗表明蛋白之間的作用越強［23］.

圖1 核心靶點PPI 網絡

2.2 GO 功能注釋和KEGG 通路富集分析

結果顯示，富集的GO 條目共140 條（P<0.05），其中，富集的BP 條目有79 條，主要包括興奮性突觸后電位（Excitatory postsynaptic potential）、化學性突觸傳遞（Chemical synaptic transmission）和神經系統過程（Neurological system process）等；富集的CC（細胞成分）條目有35 條，富集部位涉及突觸后膜（Postsynaptic membrane），蛋白酶體復合物（Proteasome complex）和突觸（Synapse）等；富集的MF 條目有26 條，主要涉及配體門控離子通道活性（Igand-gated ion channel activity）、乙酰膽堿結合（Acetylcholine binding）和神經遞質受體活性（Neurotransmitter receptor activity）等.

同時，富集的KEGG 通路有27 條（P<0.05），主要包括阿爾茨海默病（AD）、帕金森病（Parkinson disease）、脊髓小腦共濟失調（Spinocerebellar ataxia）和神經變性途徑-多種疾病（Spinocerebellar ataxia）等. 將前10 條BP、Cc、MF 富集條目和前20 條KEGG 通路繪制氣泡圖見圖2 和圖3.

圖2 石斛堿治療AD 核心靶點GO 條目氣泡圖

圖3 石斛堿治療AD 核心靶點KEGG 通路氣泡圖

2.3 石斛堿-AD“石斛堿-核心靶點-通路”網絡圖的構建

將石斛堿、核心靶點和前20 條通路數據導入Cytoscape 3.9.1 軟件，得到“石斛堿-核心靶點-通路”網絡圖 如圖4 所示，該網絡圖包含45 個節點和182 條邊. 通過對網絡節點的拓撲分析，共有GRIN2B、G R I N 2 A、G R I N 1、P S M D 2、PSMC1、PSMC4、PSMD14、PSMC6和DRD2 等9 個靶點的數據均大于DC、BC 和CC 中位數，即為石斛堿治療AD 的關鍵靶點.

圖4 “石斛堿-核心靶點-通路”網絡圖

3 結論與討論

運用網絡藥理學方法篩選石斛堿的作用靶點，篩選出石斛堿可能通過調節GRIN2B、GRIN2A、GRIN1、PSMD2、PSMC1、PSMC4、PSMD14、PSMC6 和DRD2 等 靶點來實現對AD 的治療作用. 其中， GRIN2B、GRIN2A 和GRIN1為NMDA 受體的不同亞基，NMDA 受體在全腦均有分布，是治療AD 的靶向受體［25-26］；DRD2 是一種多巴胺受體，Liu 等研究發現可通過調控DRD2/β-arrestin 2/PP2A/JNK 信號軸來改善Aβ1-42 誘導的小鼠神經炎癥和記憶缺陷，石斛堿也可能通過作用于DRD2 信號軸來改善AD 的癥狀，從而實現對AD 的防治作用［27］. 但是局限于數據庫完整性、分析軟件和機體環境的差異，關于石斛堿治療AD 的作用機理還需要進行進一步的體內、體外臨床實驗驗證，才能更好地指導石斛堿的開發和利用.