吡哆醇對魯氏接合酵母高鹽脅迫耐受的影響

陳 勝， 王文欣， 劉子雄， 宋慶怡， 上官玲玲， 姚婉婷， 陳 雄， 代 俊

（湖北工業大學生物工程與食品學院，湖北 武漢 430068）

醬油作為我國最受歡迎的調味品之一，它是以蛋白質和淀粉為原料，經微生物發酵作用釀造而成的一種產物，具有獨特、渾厚、濃郁的風味，已經成為人們生活中不可或缺的調味品之一[1]。 在醬油發酵過程中，酵母這類微生物具有產香、增鮮特性，能使醬油的風味更加良好[2]。 但是高鹽稀態法釀造醬油需要在高鹽的環境下才能實施，因此研究酵母抗高鹽脅迫的能力是提高醬油風味的重要途徑之一。魯氏接合酵母作為典型的耐鹽性酵母[3]，可以應用于食品發酵中產生獨特的香氣與風味物質，但為了更好地適應高鹽環境，還需要進一步提高魯氏接合酵母抗高鹽脅迫的能力。

關于魯氏接合酵母的耐鹽機制前人已有探索，發現其耐鹽性主要與細胞壁和細胞膜組成成分和形態、Na+轉運系統、細胞內生物相容性物質以及抗氧化還原能力有關[4]。 為了增加發酵食品的風味，進一步深入研究魯氏接合酵母的耐鹽機制是至關重要的。

前人通過外源添加物質來改變魯氏接合酵母的代謝性質， 比如添加D-果糖來改變呋喃酮代謝機制[5]，因此作者通過添加外源物質來提高魯氏接合酵母對高鹽環境的適應性。 已有文獻報道，維生素B6（vitamin B6，VB6）能夠調節酵母細胞信號傳導，調節細胞膜上離子通道，增強細胞抗脅迫能力等[6]。VB6作為一種營養豐富的物質， 添加后能提供發酵菌株更好的生長[7]；而且，VB6還能提高細胞活性，提高發酵菌株的抗逆性。 VB6是由吡哆醇（PN）、吡哆醛（PL）、吡哆胺（PM）及其磷酸化衍生物在細胞內相互轉化形成的[8]，并且磷酸吡哆醛（PLP）是由PN、PL 或PM 形成的最主要的活性形式， 還能在氨基酸代謝過程中行使輔酶的作用[9]；吡哆醇的生物合成也與硫胺素相互聯系[8]。 近年來，植物中已證明維生素B6可作為活性氧自由基（ROS）清除劑，具有增加對生物和非生物脅迫抗性因子的附加功能[10]。由此考慮吡哆醇作為提高魯氏接合酵母耐鹽性營養物質的可能性。

目前，國內外已有報道闡明了維生素對動植物的影響，不僅可以增強植物抗氧化能力，并且還可對動物的免疫功能產生影響[11-12]，但外源添加維生素對魯氏接合酵母耐鹽性影響的探究還比較少，因此本研究中主要是基于前期調研基礎上，通過在高鹽脅迫條件下，研究外源添加吡哆醇對菌株的生長狀況、 產甘油和海藻糖等生物相容性物質的能力、轉運Na+的能力等生理代謝過程的影響， 進一步提高魯氏接合酵母在增強發酵食品比如醬油風味品質的應用價值。

1 材料與方法

1.1 菌株

魯氏接合酵母（Zygosaccharomyces rouxii ）A 菌株： 中國典型培養物保藏中心提供， 保藏號為CCTCCM 2013310[13]，由作者所在實驗室分離保藏。

1.2 材料與儀器

YEPD 培養基： 20 g/L 葡萄糖，20 g/L 蛋白胨，10 g/L 酵母浸粉。 固體培養基則另加入20 g/L 瓊脂。 根據鹽質量濃度的不同分別加入18 g/dL NaCl或者14 g/dL NaCl，115 ℃滅菌20 min。

酵母浸粉：安琪酵母公司產品；葡萄糖、NaCl、無水乙醇、3，5-二硝基水楊酸：國藥集團產品；蛋白胨：北京雙旋微生物培養基制品廠產品；吡哆醇、三氯乙酸：上海麥克林公司產品；甘油含量測定試劑盒：北京普利萊公司產品；腺苷三磷酸酶試劑盒：南京建成生物工程研究所產品。

UV-722 型紫外可見光分光光度計： 上海精密科學儀器公司產品；YXQ-LS-100SⅡ型高壓蒸汽滅菌鍋、SPX-150D 型恒溫生化培養箱：上海博訊實業公司產品；5810R 型高速冷凍離心機： 德國Eppendorf 公司產品；SBA-90 型生物分析傳感儀：山東省科學院生物研究所提供；Synergy H1 全功能酶標儀：美國伯騰儀器公司產品；ZA3300 型原子吸收光譜儀： 日本HITACHI 公司產品；7890B 型氣相色譜儀、Ultimate 3000 型高效液相色譜儀： 賽默飛世爾科技公司產品。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌種活化及培養條件 首先將魯氏接合酵母菌種活化于YEPD 培養基，間隔24 h 后再次活化得到次級種子液，然后取次級種子液按照體積分數5%的接種量分別接種于含有2 g/L 吡哆醇、18 g/dL NaCl 的YEPD 培養基（實驗組）和不添加吡哆醇的YEPD 培養基中（對照組），最后在30 ℃、200 r/min條件下發酵培養并取各個生長階段的樣品測定各項生理生化特征數據。

1.3.2 吡哆醇質量濃度的確定 為了更明顯地看出不同質量濃度吡哆醇的添加對魯氏接合酵母生長的影響，避免在含18 g/dL NaCl 的YEPD 平板上生長區分度不高，因此降低鹽質量濃度，采用了含14 g/dL NaCl 的YEPD 平板進行后續實驗。 先將次級種子液稀釋到OD600nm為1, 然后按照10、100、1 000 倍梯度稀釋， 之后取0.8 μL 點樣于添加6 種梯度質量濃度吡哆醇（0～2 g/L） 的含14 g/dL NaCl的YEPD 固體培養基上，最后30 ℃恒溫培養60 h，觀察菌落的生長狀況。

1.3.3 生物量的測定 取5 mL 搖瓶發酵液，5 000 r/min 離心10 min，去上清液，加5 mL 去離子水重懸酵母細胞，相同條件離心水洗3 次，最后用5 mL去離子水重懸細胞，稀釋后以去離子水為對照在紫外可見光分光光度計600 nm 處進行比色測定，光密度OD600nm為OD 讀數與稀釋倍數的乘積。

1.3.4 細胞干質量的測定 分別用電子天平稱量干燥的離心管質量以及5 mL 搖瓶發酵液經過離心洗滌烘干至質量恒定的離心管和菌體的總質量，利用兩者之差計算出每毫升發酵液的細胞干質量。

1.3.5 葡萄糖質量濃度的測定 取2 mL 搖瓶發酵液，12 000 r/min 離心5 min， 取上清液采用3，5-二硝基水楊酸法（DNS）測定發酵液中葡萄糖的質量濃度[14]。

1.3.6 乙醇產量的測定 取2 mL 搖瓶發酵液，12 000 r/min 離心5 min， 取上清液使用SBA-90 型生物分析傳感儀測量[15]。

1.3.7 甘油含量的測定 使用甘油含量測定試劑盒測定細胞內外甘油的含量。

1.3.8 細胞內海藻糖質量分數的測定 取5 mL 搖瓶發酵液，5 000 r/min 離心10 min，去上清液，用冰水清洗3 次后收集菌體。 在菌體中加入4 mL 0.5 mol/L 的三氯乙酸，振蕩均勻后置于冰水混合物中，每15min 振蕩一次，1 h 后于3 000 r/min 離心5 min，吸取1 mL 上清液于試管中， 加入5 mL 硫酸蒽酮，沸水浴10 min，冷卻后于630 nm 處測定OD 值。 再制作海藻糖標準曲線，將樣品測得的OD630nm值根據標準曲線計算出海藻糖質量分數，以細胞干質量計[16]。

1.3.9 細胞內鈉鉀比率（Na+/K+）的測定 使用原子吸收光譜儀測定細胞內的鈉和鉀離子的質量濃度[13]。

1.3.10 Na+/K+-ATP 酶活性的測定 采用腺苷三磷酸酶試劑盒測定，結果以蛋白質質量計[13]。

1.3.11 2-苯乙醇產量的測定 取1 mL 搖瓶發酵液，5 000 r/min 離心10 min， 收集上清液， 用0.22 μm 有機系濾膜過濾，采用高效液相色譜法測定2-苯乙醇的產量。 檢測條件為Venusil MP C18色譜柱(4.6 mm×250 mm)，進樣量為10 μL，流動相中甲醇與水體積比為6∶4，流量為0.6 mL/min，柱溫為30 ℃，檢測波長為210 nm，檢測時間為20 min[17]。

1.3.12 統計分析 采用Origin 9.0、GraphPad Prism 5等軟件對數據進行處理并繪圖，顯著性水平設置為1%。 實驗均重復3 次，圖表中數據結果用“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 促進魯氏接合酵母生長的最佳吡哆醇質量濃度的確定

吡哆醇主要是通過進入細胞內轉化成磷酸吡哆醛（PLP）的活性形式來作為相關反應酶的輔酶或者底物，從而參與各種合成代謝反應。 魯氏接合酵母可以耐受18 g/dL 的NaCl，但基于前期基礎，為了使酵母生長實驗結果對比更加明確，本實驗中選用了含14 g/dL NaCl 的YEPD 固體培養基來探究添加不同質量濃度的吡哆醇對魯氏接合酵母生長的影響，結果如圖1 所示。 結果表明，魯氏接合酵母在不同質量濃度吡哆醇的影響下， 外源添加2 g/L 吡哆醇時的生長狀況最好，而其他質量濃度對魯氏接合酵母的促生長作用并不明顯。沒有做更高質量濃度下吡哆醇的促生長作用是因為2 g/L 的質量濃度相對較高，再提高質量濃度已經不再適合工業上擴大生產。 所以最終選取外源添加2 g/L 的吡哆醇來探究其對魯氏接合酵母抗高鹽脅迫機制的影響。

圖1 不同質量濃度吡哆醇對魯氏接合酵母生長的影響Fig. 1 Effect of pyridoxine with different concentrations on the growth of Zygosaccharomyces rouxii

2.2 吡哆醇的添加對魯氏接合酵母細胞生長和葡萄糖消耗的影響

魯氏接合酵母在生長過程中伴隨著糖類物質的消耗，從而提供能量供自己生長以及產生其他物質如乙醇、甘油等來應對外界脅迫的壓力。 探究在含18 g/dL NaCl 的YEPD 液體培養基中添加吡哆醇對魯氏接合酵母細胞生長和葡萄糖消耗的影響，結果如圖2 所示。 在對照組中，魯氏接合酵母經歷了36 h 的延滯期后才進入對數期快速生長，葡萄糖也是剛好在36 h 被快速消耗。 與對照組相比，實驗組消耗葡萄糖的速度更快，進入對數期的時間也提前了24 h，相當于縮短了2/3 的延滯期，并且從圖中可以判斷出在72 h 后兩者進入穩定期，此時對照組與實驗組的OD600nm值分別為9.4、10.4，生物量提高了10.6%， 表明吡哆醇的添加不僅可以縮短延滯期的時間，還可以促進魯氏接合酵母的生物量積累。

圖2 吡哆醇的添加對魯氏接合酵母細胞生長和葡萄糖消耗的影響Fig. 2 Effect of pyridoxine on cell growth and glucose consumption of Zygosaccharomyces rouxii

在12 h 內， 實驗組的葡萄糖質量濃度降低了8%，但OD600nm值總體變化很小，這種現象表明添加吡哆醇能夠促進魯氏接合酵母對葡萄糖的利用，生物量變化很小，進一步說明對葡萄糖的利用更可能用于合成維持細胞滲透壓穩定的物質來抵抗外界的脅迫。 細胞內主要是甘油和海藻糖等物質，合成的這些物質可以提高魯氏接合酵母在高鹽脅迫下的耐受性。 但這只是初步推測，吡哆醇的添加能否加快葡萄糖的代謝來用于合成甘油以及海藻糖等物質還需下一步實驗來判斷。而在12 h 之后隨著葡萄糖的不斷消耗，生物量快速增加，這種現象表明，添加吡哆醇能加快生物代謝，促進葡萄糖的吸收利用。 磷酸吡哆醛是吡哆醇的活性形式，在140 多種不同的酶反應中行使輔因子功能，在酵母的生長代謝中發揮重要作用[18]。因此，在高鹽脅迫下添加吡哆醇能夠加快氨基酸代謝刺激酵母的生長，合成相關物質維持細胞的滲透壓平衡。

2.3 吡哆醇的添加對魯氏接合酵母乙醇產量的影響

乙醇作為來源廣泛、清潔、可再生的燃料，有利于發展綠色循環經濟。 在醬油生產過程中，乙醇有利于醬油的保存[19]，提高乙醇產量可提高醬油的質量。 添加吡哆醇對魯氏接合酵母乙醇產量的影響如圖3 所示。 結果表明，添加吡哆醇的實驗組在剛進入對數期后乙醇產量大幅度提高，隨著葡萄糖的消耗， 乙醇產量從12 h 的0.15 g/L 漲到最大值30 h的4.20 g/L，當葡萄糖幾乎消耗完時，乙醇產量才逐漸下降。 與對照組相比（對照組乙醇產量最大達到4.00 g/L），乙醇產量增加了5%。

圖3 吡哆醇的添加對魯氏接合酵母乙醇產量的影響Fig. 3 Effect of pyridoxine on the ethanol production of Zygosaccharomyces rouxii

上述實驗結果表明外源添加吡哆醇可以提高魯氏接合酵母的乙醇產量，這可能是因為氨基酸代謝形成的碳骨架有利于糖的合成，為糖酵解途徑產生乙醇提供了可能[20]。 而且芳香族氨基酸代謝有利于提高菌株對乙醇的耐受性從而增加乙醇的產量[21]。外源添加吡哆醇還可以促進硫胺素的合成[8]， 硫胺素焦磷酸能作為輔助因子促進丙酮酸脫羧形成乙醛，乙醛進一步還原成乙醇，進而提高乙醇的產量[13]。

2.4 吡哆醇的添加對魯氏接合酵母甘油含量和細胞內海藻糖質量分數的影響

甘油和海藻糖作為重要的生物相容性物質，在魯氏接合酵母受到高鹽脅迫時會發揮關鍵的作用。比如擁有較好親水性能的多羥基的甘油，能夠維持細胞內的水分活度，平衡細胞內外的滲透壓，并且高滲甘油(high osmolarity glycerol, HOG)應答途徑是真核細胞應答高滲透壓脅迫的關鍵響應機制[22]，能讓細胞在高鹽條件下避免脫水死亡。 海藻糖是一種典型的應激代謝產物，由于其特殊的物理性質和穩定的化學結構，在酵母細胞面臨高滲透壓等惡劣環境時形成一層保護膜，能有效地保護酵母細胞結構不被破壞；此外海藻糖的水解還可為蛋白質恢復活性提供能量，從而維持酵母細胞在脅迫條件下的生存[23]。 因此，甘油和海藻糖的含量變化關系著酵母細胞抗逆性的強弱。 探究在高鹽脅迫下吡哆醇的添加對魯氏接合酵母細胞內外甘油含量的影響，結果如圖4 所示。 由圖4（a）可知，對照組在前48 h 內，細胞內甘油隨著葡萄糖的消耗而穩定地合成，在48 h 時達到最大積累量（48.81 mg/g，以細胞干質量計），此時魯氏接合酵母剛好進入對數期中期，細胞快速生長，之后細胞內甘油代替葡萄糖作為碳源快速消耗，以維持細胞繼續生長。 在實驗組中，添加吡哆醇后，魯氏接合酵母細胞內甘油在24 h 時達到最大積累量（45.46 mg/g），隨后也如對照組一般快速消耗，但兩組每克干細胞所積累甘油的最大值并無明顯差別（P＞0.05）。 這說明在吡哆醇的外源添加影響下，魯氏接合酵母能在高鹽高滲環境中提前激活HOG 應答途徑，從而提前合成和積累甘油，為延滯期細胞提供更多地保護， 平衡細胞內的滲透壓，以盡快適應高鹽高滲環境。

圖4 吡哆醇的添加對魯氏接合酵母細胞內外甘油含量的影響Fig. 4 Effect of pyridoxine on the intracellular and extracellular glycerol content of Zygosaccharomyces rouxii

吡哆醇的添加對細胞外甘油的影響如圖4（b）所示。 實驗組在前30 h 內細胞外甘油不斷積累，且在30 h 達到最大值13.95 mmol/L， 隨后快速消耗。而對照組細胞外甘油在前54 h 內積累， 在54 h 達到最大值18.05 mmol/L，比實驗組高出29%。這表明在細胞剛開始生長時， 葡萄糖作為主要碳源被消耗，從而細胞外甘油開始積累，而在葡萄糖消耗完后，細胞外甘油可以被吸收到細胞內作為遲效碳源繼續供細胞生長。 在高鹽高滲條件下，外源添加吡哆醇后，魯氏接合酵母細胞能夠促進細胞外甘油進入細胞，從而達到更多的生物量，并且還可以更好地平衡滲透壓， 使細胞在高鹽高滲條件下生存下去，提高酵母耐鹽性。

吡哆醇的添加對魯氏接合酵母細胞內海藻糖質量分數的影響如圖5 所示。 實驗組和對照組細胞內海藻糖都在前12 h 快速消耗，并且在前48 h 內，實驗組的海藻糖比對照組的海藻糖消耗的更多，分解速率更快，由此可知外源添加吡哆醇后，細胞內海藻糖消耗加快，為細胞代謝提供碳源，這是因為吡哆醇會參與氨基酸的各種反應，促進酵母細胞的生長代謝，從而加速海藻糖的吸收利用。

圖5 吡哆醇的添加對魯氏接合酵母細胞內海藻糖質量分數的影響Fig. 5 Effect of pyridoxine on the intracellular trehalose content of Zygosaccharomyces rouxii

高鹽脅迫條件下，酵母會產生一些生物相容性物質來平衡滲透壓，以防止細胞失水死亡或維持細胞內各種穩態。 甘油和海藻糖作為經典的滲透調節物質，從實驗結果來看，魯氏接合酵母更依賴于甘油的富集來對抗高鹽的脅迫， 而并非海藻糖的積累。 在高鹽脅迫條件下，添加吡哆醇后，魯氏接合酵母細胞內甘油合成明顯提前， 細胞外甘油外排減少，從而提高細胞在高鹽條件下的適應性。 而對于海藻糖而言，添加吡哆醇后，消耗反而增加，這表明外源添加的吡哆醇會促進海藻糖作為碳源被消耗，而非將其作為保護性物質，但其加速消耗也為酵母生長提供了有利條件。 上述結果表明，魯氏接合酵母在高鹽脅迫條件下主要是利用甘油的生物相容性來增強其抗脅迫的能力， 而外源添加吡哆醇后，有利于甘油提前合成， 更早去抵抗高鹽脅迫的環境，同時也加快了海藻糖的利用，提高生物量，使細胞能更快適應高鹽高滲環境。

2.5 吡哆醇的添加對魯氏接合酵母細胞內Na+/K+及Na+/K+-ATP 酶活性的影響

Na+/K+-ATP 酶作為分布在細胞膜上的膜結合蛋白酶，主要功能是排出過量鈉離子，解除鈉離子對細胞的毒性，維持鉀離子穩態和細胞內pH 穩定，平衡細胞內外滲透壓與維持細胞膜完整性，其酶活性大小關系著細胞抗高鹽脅迫能力的強弱[24]。 魯氏接合酵母在高鹽脅迫條件下， 細胞內Na+含量遠大于K+， 此時為了避免Na+的毒性， 就需要Na+/K+-ATP 酶依賴于ATP 的能量將Na+從細胞內轉運到細胞外，將K+轉運到細胞內，平衡細胞內外離子差以及滲透壓。 吡哆醇的添加對魯氏接合酵母細胞內Na+/K+及Na+/K+-ATP 酶活性的影響如圖6 所示。 結果表明，整個生長時期，對照組細胞內Na+/K+一直持續下降， 而實驗組Na+/K+是對數期先下降， 穩定期Na+/K+些許上升，原因可能為在高鹽脅迫下，細胞會產生一些活性氧自由基（ROS）[25],而這些活性氧自由基會對細胞膜造成損傷，從而影響Na+/K+-ATP 酶活性，導致Na+/K+上升。 在延滯期時，實驗組的Na+/K+比對照組低26.5%（P＜0.05）；而在對數期，實驗組的Na+/K+比對照組低82.3%（P＜0.05）。從延滯期到對數期，添加吡哆醇后，實驗組的Na+/K+下降的幅度遠高于對照組，表明在高鹽脅迫條件下，吡哆醇增強了細胞膜上離子通道的調節作用，有利于Na+的外排。由圖6（b）可知，在對數期，實驗組Na+/K+-ATP 酶活性比對照組高16.9%； 在穩定期， 實驗組Na+/K+-ATP 酶活性比對照組高35.2%。 而無論是對數期還是穩定期，實驗組的Na+/K+-ATP 酶活性都比對照組的高，這一點證明了在高鹽脅迫下，外源添加吡哆醇能夠促進Na+/K+-ATP 酶活性，調節細胞內外離子平衡以及滲透平衡， 降低Na+對酵母細胞的毒害作用從而增加細胞活性。

圖6 吡哆醇的添加對魯氏接合酵母細胞內Na+/K+及細胞膜上Na+/K+-ATP 酶活性的影響Fig. 6 Effect of pyridoxine on the ratio of Na+/K+ in the cell and the activity of Na+/K+-ATPase on the cell membrane of Zygosaccharomyces rouxii

2.6 吡哆醇的添加對魯氏接合酵母2-苯乙醇產量的影響

2-苯乙醇作為效用普遍、價值可觀的高級芳香醇，其特有的玫瑰香氣對醬油風味的形成起重要作用。 醬油發酵中若是缺少這種香味物質，則其風味就會淡薄[26]。 因此提高2-苯乙醇的產量不僅有利于增加發酵食品的風味，使其更受歡迎，并且也為生產2-苯乙醇提供一定的參考。吡哆醇的添加對魯氏接合酵母2-苯乙醇產量的影響如圖7 所示。結果表明，實驗組在對數期魯氏接合酵母的2-苯乙醇產量為11.50 mg/L，比對照組的2-苯乙醇產量（1.55 mg/L）提高了6.42 倍；在穩定期，對照組的2-苯乙醇產量為13.13 mg/L，實驗組為29.64 mg/L，相比于對照組提高了1.26 倍。這表明，在高鹽脅迫條件下，外源添加的吡哆醇可以通過在氨基酸代謝中行使輔酶功能（包括轉氨作用、脫羧作用等[18]）提高魯氏接合酵母2-苯乙醇的產量。這是因為酵母產生2-苯乙醇涉及氨基酸的轉運與調控，而吡哆醇在其氨基酸代謝中起著重要作用， 因此才促進產量增加高達6.42 倍。上述結果表明， 魯氏接合酵母在高鹽脅迫條件下，外源添加行使輔酶功能的吡哆醇能夠促進2-苯乙醇產量的提高。

圖7 吡哆醇的添加對魯氏接合酵母的2-苯乙醇產量影響Fig. 7 Effect of pyridoxine on the production of 2-phenylethanol of Zygosaccharomyces rouxii

3 結 語

研究結果表明，在高鹽脅迫條件下，添加吡哆醇（2 g/L）提高了魯氏接合酵母細胞對高鹽脅迫的耐受性， 縮短了高鹽脅迫條件下酵母生長的延滯期，提高了生物量，有利于食品發酵中香味物質的提前形成以及風味增加； 還促進了甘油的提前合成，使細胞提前適應高鹽環境，以及提高了細胞膜上Na+/K+-ATP 酶活性，降低Na+的毒害作用從而提高細胞活性。 除此之外，吡哆醇的添加還提高了乙醇和2-苯乙醇的產量，對醬油的保存和增香有很大的促進作用，最終提高了醬油的風味。

由此可見，吡哆醇的添加能提高魯氏接合酵母對高鹽脅迫的耐受能力，提高在高鹽脅迫條件下的生物量，增加發酵過程中風味物質的含量，實驗結果給工業上提高醬油等發酵食品風味提供了一定的思路和參考，以及有助于探索耐鹽產香酵母風味形成的機理。 作者初步探索了吡哆醇這類維生素對魯氏接合酵母高鹽脅迫耐受的影響，更深的分子機理以及其他類物質對其是否有同類作用還需進一步探究。