重組大腸桿菌全細胞催化合成NMN

曾偉主， 石選平， 黃忠實， 張?zhí)烀龋?張偉平， 周景文*

（1. 江南大學(xué)未來食品科學(xué)中心，江蘇 無錫 214122；2. 江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122；3. 華熙生物科技股份有限公司，山東 濟南 250101）

β-煙酰胺單核苷酸（NMN）是人體內(nèi)一種重要的核苷酸化合物[1]。在細胞內(nèi)，NMN 主要通過轉(zhuǎn)化生成煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 （nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）來發(fā)揮其重要的生理功能，包括激活NAD+依賴組蛋白脫乙酰酶（sirtuins）活性、影響細胞存活以及維持細胞氧化還原狀態(tài)等[2-3]。NAD+在生物新陳代謝、抗衰老，以及治療帕金森病、阿爾茨海默病、抑郁癥、糖尿病和其他衰老相關(guān)疾病等方面具有重要作用[4]。 由于其分子大和具有電荷，NAD+很難直接進入細胞，通常需要通過補充其前體來提高NAD+在細胞內(nèi)的含量， 從而起到抗衰老等作用。 研究表明，口服NMN 能夠在體內(nèi)迅速轉(zhuǎn)化成NAD+，因此被認為是NAD+很好的替代品[5-6]。 近年來，NMN 在醫(yī)學(xué)上的功能受到廣泛研究。NMN 在一些天然來源的食物中含量豐富，包括毛豆、西蘭花、鱷梨、蘑菇、生牛肉和蝦等，同時，NMN 具有較高的食品安全性，未顯示出任何明顯毒性和副作用[7-8]。隨著生活水平的提高和人口老齡化問題的加重，人們對抗衰老類藥物的追求愈發(fā)強烈，NMN 的市場需求量不斷增加[9]。

目前，NMN 的合成方法主要包括化學(xué)合成法和生物合成法。 已知的最新化學(xué)合成法主要包括兩種：一種是以四乙酰核糖和煙酰酸乙酯為原料進行合成，另一種是以氯磷酸二苯酯作為磷酸化試劑進行合成[10]。但由于存在生產(chǎn)效率和產(chǎn)品純度較低、分離難度大以及生產(chǎn)成本高等問題，化學(xué)合成法合成NMN 仍受到一定限制[11]。 因此，過程簡單、對環(huán)境友好的生物合成法凸顯優(yōu)勢。 大腸桿菌（Escherichia coli）作為常用的模式菌株，其生長迅速、基因操作簡單，已被廣泛應(yīng)用于合成多種高價值化合物[12-13]。生物合成法合成NMN 也主要將宿主聚焦于大腸桿菌中。Marinescu 等在大腸桿菌中表達來源杜克雷嗜血桿菌（Haemophilus ducreyi）的煙酰胺磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶 （HdNadV）， 以煙酰胺為底物合成了15.42 mg/L 的NMN[14]。 Black 等通過過量表達來源于土拉弗朗西斯菌 （Francisella tularensis） 的NMN 合酶（FtNadE） 以及敲除pncC 和nadR 兩個基因，將NMN 的產(chǎn)量提高至501 mg/L[15]。 Shoji 等通過篩選高效的煙酰胺磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶（NAMPT）以及兩個轉(zhuǎn)運蛋白（NiaP 和PnuC），并構(gòu)建大腸桿菌全細胞催化體系，以NAM 和葡萄糖為底物合成了6.79 g/L的NMN，轉(zhuǎn)化率為86%[16]。

作者所在研究團隊在前期研究過程中，通過在大腸桿菌E. coli BL21（DE3）中敲除與NMN 分解和調(diào)控相關(guān)的基因nadR、pncC、ushA 和purR，并對比不同來源的 NAMPT， 確定來源于 Vibrio bacteriophage 的效果最佳， 再引入蕈狀芽孢桿菌（Bacillus mycoides）的轉(zhuǎn)運蛋白BMpnuC，優(yōu)化表達各模塊基因后， 構(gòu)建了一株能以NAM 和葡萄糖為底物高產(chǎn)NMN 的工程菌株E.coli BL21（DE3）-NF017，NMN 生成量為16.2 g/L[17]。相比于微生物發(fā)酵法，全細胞催化法能夠顯著降低中間代謝產(chǎn)物的積累，從而利于產(chǎn)物的后期分離提取。 近年來，全細胞催化法被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)一些高價值目標產(chǎn)物。 基于此，作者利用全細胞催化法進行NMN 的合成。 在搖瓶水平上考察了菌株發(fā)酵過程所用培養(yǎng)基類型、誘導(dǎo)溫度和異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）濃度，以及全細胞催化過程的反應(yīng)體系初始pH、反應(yīng)溫度和底物NAM 與葡萄糖添加比例（質(zhì)量濃度比）對催化合成NMN 的影響。 在5 L 發(fā)酵罐水平上進一步探究了催化過程中溶氧水平和底物NAM 流加方式對合成NMN 的影響。 最終，應(yīng)用恒定速度流加NAM 的補料方式， 強化了全細胞催化合成NMN，為實現(xiàn)NMN 的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株大腸桿菌Escherichia coli BL21（DE3）-NF017 為作者所在實驗室在前期的研究工作中構(gòu)建，用于合成NMN[17]。

1.1.2 主要試劑 蛋白胨、酵母提取物：Oxoid 公司產(chǎn)品；卡那霉素（Km）、鏈霉素（Sm）、IPTG：上海生工生物工程有限公司產(chǎn)品； 葡萄糖、 甘油、K2HPO4、KH2PO4、NaCl 等： 上海國藥集團產(chǎn)品； 煙酰胺（NAM）、β-煙酰胺單核苷酸（NMN）：上海麥克林生化科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 搖床：上海知楚儀器有限公司產(chǎn)品；5 L 發(fā)酵罐：迪必爾生物工程（上海）有限公司產(chǎn)品； 高效液相色譜儀： 美國Agilent 公司產(chǎn)品；BioPhotometer D30 分光光度計、 離心機： 德國Eppendorf 公司產(chǎn)品； 葡萄糖-乳酸生物傳感器分析儀：深圳市西爾曼科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.4 培養(yǎng)基

1）LB 培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10.0，酵母提取物5.0，NaCl 10.0，固體培養(yǎng)基添加20.0 g/L 的瓊脂粉；121 ℃滅菌15 min。

2）TB 培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨12.0，酵母提取物24.0，甘油5.0，K2HPO412.5，KH2PO42.3；121 ℃滅菌15 min。

3）搖瓶發(fā)酵合成培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖20.0，酵母提取物 10.0，KH2PO46.0，K2HPO4·3H2O 1.4，MgSO4·7H2O 1.0， 硫酸銨6.0， 一水合檸檬酸1.1；121 ℃滅菌15 min。

4）5 L 發(fā)酵罐發(fā)酵合成培養(yǎng)基 （g/L）： 葡萄糖10.0， 酵母提取物10.0，KH2PO46.0，K2HPO4·3H2O 1.4， MgSO4·7H2O 1.0， 硫酸銨6.0， 一水合檸檬酸1.1；121 ℃滅菌15 min。

5）補料培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖600.0，酵母提取物10.0，MgSO4·7H2O 9.0；121 ℃滅菌15 min。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株培養(yǎng)方法

1）種子培養(yǎng) 將保存在-80 ℃冰箱中的菌株取出，在具有卡那霉素和鏈霉素抗性的固體平板上劃線，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h， 挑取平板上的單菌落轉(zhuǎn)接至裝有25 mL 種子培養(yǎng)基（LB 培養(yǎng)基）的250 mL 搖瓶中，37 ℃、200 r/min 培養(yǎng)12 h。

2）搖瓶發(fā)酵培養(yǎng) 將活化后的種子液以2%的接種體積分數(shù)接種至裝有25 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL 搖瓶中，在37 ℃、200 r/min 條件下培養(yǎng)，當OD600nm為0.8～1.0 時， 加入終濃度為0.2 mmol/L 的IPTG 進行誘導(dǎo)，37 ℃、200 r/min 繼續(xù)培養(yǎng)至16 h。

3）5 L 發(fā)酵罐培養(yǎng) 將活化后的種子液以10%的接種體積分數(shù)接種至裝有120 mL 種子培養(yǎng)基的2 L 搖瓶中，37 ℃、200 r/min 培養(yǎng)12 h。 將二級種子液以4%的接種體積分數(shù)接入5 L 發(fā)酵罐中， 裝液量為3.5 L，初始轉(zhuǎn)速為300 r/min，通氣量為1.0 L/（L·min），通過與轉(zhuǎn)速關(guān)聯(lián)控制發(fā)酵過程溶氧（DO）水平在30%， 補加體積分數(shù)50%的氨水控制過程pH 為7.0，37 ℃下培養(yǎng)至OD600nm為10 ～12 時，加入終濃度為0.2 mmol/L 的IPTG 進行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)后補加補料培養(yǎng)基，控制發(fā)酵液中葡萄糖質(zhì)量濃度在2.0 g/L 左右，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)至18 h。

1.2.2 全細胞催化合成NMN

1）搖瓶水平 將搖瓶上誘導(dǎo)培養(yǎng)后的發(fā)酵液在4 ℃、3 500 r/min 條件下離心30 min 收集菌體，重懸于全細胞催化體系中，催化反應(yīng)體系組成（g/L）：Na2HPO46.8、 K2HPO43.0、NH4Cl 1.0、NaCl 0.5、煙酰胺1.0、葡萄糖4.0，最終菌體OD600nm為10。

2）5 L 發(fā)酵罐水平 將發(fā)酵罐上誘導(dǎo)培養(yǎng)后的發(fā)酵液在4 ℃、3 500 r/min 條件下離心30 min 收集菌體，重懸于全細胞催化體系中。 分批催化反應(yīng)體系組成（g/L）：Na2HPO46.8、K2HPO43.0、NH4Cl 1.0、NaCl 0.5、煙酰胺10.0、葡萄糖40.0，最終菌體OD600nm為40； 補料催化反應(yīng)體系組成（g/L）：Na2HPO46.8、K2HPO43.0、NH4Cl 1.0、NaCl 0.5、煙酰胺1.0、葡萄糖4.0，最終菌體OD600nm為40。 全細胞催化過程初始轉(zhuǎn)速為300 r/min， 通氣量為0.8 L/（L·min），根據(jù)不同策略控制反應(yīng)過程中溶氧水平以及底物煙酰胺的補加方式。

1.2.3 檢測方法

1）菌體濃度檢測 用超純水稀釋發(fā)酵液至合適倍數(shù)， 使用分光光度計在600 nm 波長下測定OD 值。

2）葡萄糖質(zhì)量濃度檢測 利用葡萄糖-乳酸生物傳感器分析儀測定發(fā)酵液和全細胞催化體系中葡萄糖的質(zhì)量濃度。

3）NAM、NMN 質(zhì)量濃度檢測 采用高效液相色譜法 （HPLC） 檢測全細胞催化反應(yīng)液中NAM、NMN 的質(zhì)量濃度。 色譜柱：Hypersil ODS-2 C18色譜柱（4.6 mm×250 mm）；檢測器：紫外檢測器；檢測條件：流動相20 mmol/L 乙酸銨和乙腈（體積比95∶5），流量1.0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長259 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)酵培養(yǎng)基的對比

以菌株E.coli BL21（DE3）-NF017 為出發(fā)菌株，充分活化后， 分別在TB 培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)16 h。離心收集菌體，重懸至合成NMN 的全細胞催化體系中，最終OD600nm為10，分別取4 h 和6 h 的反應(yīng)體系樣品檢測NMN 的生成量，結(jié)果如圖1 所示。 由圖1（a）可知，誘導(dǎo)培養(yǎng)后，菌株在TB 培養(yǎng)基中的OD600nm為12.45， 在合成培養(yǎng)基中的OD600nm為8.65， 菌株在TB 培養(yǎng)基中的生長情況明顯優(yōu)于其在合成培養(yǎng)基中的生長情況。 然而，將相同OD600nm的濕菌體用于全細胞催化合成NMN，發(fā)現(xiàn)利用合成培養(yǎng)基培養(yǎng)得到的菌體更有利于NMN的合成，反應(yīng)6 h 后，利用合成培養(yǎng)基發(fā)酵得到的菌體能夠催化合成0.75 g/L 的NMN， 而利用TB 培養(yǎng)基發(fā)酵得到的菌體僅能夠合成0.39 g/L 的NMN（見圖1（b））。 對比合成培養(yǎng)基和TB 培養(yǎng)基的組成，合成培養(yǎng)基成分更加多樣，其中的MgSO4·7H2O、一水合檸檬酸等成分可能更有利于NMN 合成過程中相關(guān)基因的表達。 另外，對比TB 培養(yǎng)基，合成培養(yǎng)基大大減少了有機氮源的使用， 從而更有利于降低NMN 實際生產(chǎn)中的成本。 因此，選取合成培養(yǎng)基作為后續(xù)菌株培養(yǎng)用發(fā)酵培養(yǎng)基。

圖1 不同發(fā)酵培養(yǎng)基對菌株生長及催化生成NMN 的影響Fig. 1 Effects of different fermentation media on cell growth and catalytic synthesis of NMN

2.2 誘導(dǎo)溫度及IPTG 濃度對催化合成NMN 的影響

誘導(dǎo)溫度和IPTG 濃度是影響外源蛋白質(zhì)表達的重要因素[18-19]。 考察了菌株培養(yǎng)過程中不同誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)劑IPTG 濃度對合成NMN 的影響，研究發(fā)現(xiàn)當誘導(dǎo)溫度為25 ℃時，菌體量較低，另外，在實際的工業(yè)生產(chǎn)中， 控制25 ℃的發(fā)酵溫度通常需要制冷，從而會導(dǎo)致生產(chǎn)成本增加。 因此，選擇30 ℃和37 ℃兩個誘導(dǎo)溫度， 并結(jié)合不同的誘導(dǎo)劑IPTG 添加濃度（0.2、0.5、1.0 mmol/L）進行研究。分別取反應(yīng)2、4、6 h 的反應(yīng)體系樣品， 檢測NMN 的生成量（質(zhì)量濃度），結(jié)果如圖2 所示。 在催化反應(yīng)6 h內(nèi)，隨著催化時間的延長，NMN 的生成量不斷增加。在相同的反應(yīng)時間內(nèi)，37 ℃誘導(dǎo)得到的菌體催化合成的NMN 生成量明顯高于30 ℃誘導(dǎo)得到的菌體催化合成的NMN 生成量。 另外， 在同一誘導(dǎo)溫度下，NMN 的生成量隨誘導(dǎo)劑IPTG 濃度的增加反而呈下降趨勢， 這可能由高濃度IPTG 對菌體有一定毒性所導(dǎo)致。 當誘導(dǎo)溫度為37 ℃、IPTG 濃度為0.2 mmol/L 時，NMN 的生成量最高， 反應(yīng)6 h 后其生成量為1.15 g/L。 綜上，選擇誘導(dǎo)溫度37 ℃、IPTG濃度0.2 mmol/L 用于制備全細胞催化合成NMN 所用濕菌體。

圖2 不同誘導(dǎo)溫度和IPTG 濃度對催化合成NMN 的影響Fig. 2 Effects of different induction temperature and IPTG concentration on catalytic synthesis of NMN

2.3 搖瓶水平全細胞催化條件的優(yōu)化

2.3.1 反應(yīng)體系不同初始pH 對催化合成NMN 的影響 研究表明，pH 能影響酶的構(gòu)象以及底物和產(chǎn)物等的解離， 從而影響催化反應(yīng)的進行和平衡，因此，應(yīng)用大腸桿菌全細胞催化法生成特定目標產(chǎn)物通常需要在一定的pH 范圍內(nèi)進行[20-21]。本研究中考察了全細胞催化體系中不同初始pH（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）對催化合成NMN 的影響，分別取催化反應(yīng)2、4、6 h 的反應(yīng)體系樣品， 檢測NMN 的生成量（質(zhì)量濃度），結(jié)果如圖3 所示。 在相同的反應(yīng)時間內(nèi)，NMN 的生成量隨初始pH 的變化呈鐘形；當初始pH 在6.0～7.0 時，NMN 生成量呈現(xiàn)上升趨勢；而當在初始pH 在7.0～8.0 時，NMN 生成量呈現(xiàn)下降趨勢。 當初始pH 為7.0 時，催化合成NMN 的效果最好，反應(yīng)6 h 后NMN 的生成量達1.21 g/L。

圖3 不同初始pH 對催化合成NMN 的影響Fig. 3 Effect of different initial pH on catalytic synthesis of NMN

2.3.2 反應(yīng)體系不同溫度對催化合成NMN 的影響在優(yōu)化了全細胞催化體系的初始pH 后， 又考察了全細胞催化過程中不同反應(yīng)溫度對NMN 合成的影響。 通常來說，反應(yīng)溫度對全細胞催化的效率和速率具有較大影響，不同溫度下胞內(nèi)酶的活性不同[21]。本研究中分別比較了在25、30、37 ℃下全細胞催化合成NMN 的情況，結(jié)果如圖4 所示。 發(fā)現(xiàn)在反應(yīng)溫度為37 ℃的條件下，菌體催化合成NMN 明顯受到抑制，反應(yīng)6 h 時僅積累了0.24 g/L 的NMN，顯著低于反應(yīng)溫度為25 ℃（1.37 g/L）和30 ℃（1.46 g/L）時的生成量；另外，當催化時間延長至12 h，不同反應(yīng)溫度下NMN 的生成量均有所降低， 表明反應(yīng)生成的NMN 有所降解。 研究發(fā)現(xiàn)，細胞內(nèi)的NMN 能夠被少量降解生成NAD+用于菌體生長， 從而降低細胞內(nèi)NMN 的積累[16-17]。 綜上，全細胞催化過程中控制30 ℃的反應(yīng)溫度更有利于NMN 的合成。

圖4 不同反應(yīng)溫度下NMN 的合成情況Fig. 4 Synthesis of NMN at different reaction temperatures

2.3.3 底物添加比例對催化合成NMN 的影響 在催化底物NAM 合成NMN 過程中，磷酸核糖焦磷酸（PRPP） 是另一重要的直接底物，PRPP 通常由葡萄糖經(jīng)磷酸戊糖途徑生成[22]。 另外，在大腸桿菌中，葡萄糖又能夠被糖酵解等代謝途徑消耗，從而降低葡萄糖經(jīng)磷酸戊糖途徑代謝生成PRPP 的效率。 為了增加大腸桿菌全細胞催化NAM 合成NMN 的生成量， 本研究中考察了全細胞催化體系中底物NAM和葡萄糖的不同添加比例（ρNAM∶ρGlu=1∶2～1∶5）對NMN合成的影響，即分別在全細胞催化體系中加入1.0 g/L 的底物NAM 以及對應(yīng)不同質(zhì)量濃度的底物葡萄糖（2.0、3.0、4.0、5.0 g/L），結(jié)果如圖5 所示。 總的來說， 全細胞催化過程中NMN 的生成量大致隨葡萄糖添加量的增多而增加； 當催化反應(yīng)10 h 時，ρNAM∶ρGlu=1∶4 時效果最好，NMN 的最高生成量達1.84 g/L，略高于在ρNAM∶ρGlu=1∶5 時的生成量（1.81 g/L）?？紤]到添加葡萄糖的成本問題，后續(xù)研究選取ρNAM∶ρGlu=1∶4。 另外，與前期研究結(jié)果相似，延長催化反應(yīng)時間至18 h， 在底物NAM 和葡萄糖的不同添加比例下，NMN 的生成量均有所下降。

圖5 不同底物添加比例對催化合成NMN 的影響Fig. 5 Effect of different substrate addition ratios on catalytic synthesis of NMN

2.4 5 L 發(fā)酵罐水平放大

2.4.1 全細胞催化過程中不同溶氧水平對合成NMN 的影響 基于在搖瓶水平上優(yōu)化得到菌株的最適生長條件和全細胞催化生成NMN 的條件，為了進一步提高NMN 的生成量， 在5 L 發(fā)酵罐上進行放大。 首先，為了提高在發(fā)酵罐上培養(yǎng)的菌體量，采用補料分批發(fā)酵培養(yǎng)模式， 經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)后OD600nm達到41.6（見圖6（a））。 離心收集得到濕菌體，加入分批催化反應(yīng)體系中（NAM 10.0 g/L、葡萄糖40.0 g/L、最終菌體OD600nm為40.0），考察全細胞催化過程中控制溶氧水平對合成NMN 的影響。 研究發(fā)現(xiàn)， 全細胞催化過程中控制一定水平的溶氧更有利于NMN 的合成， 當反應(yīng)20 h 后不控制溶氧水平的NMN 生成量為4.80 g/L（見圖6（b））；當溶氧水平控制在30%時， 反應(yīng)20 h 后NMN 的生成量為5.92 g/L（見圖6（c））；當溶氧水平控制在40%時，反應(yīng)20 h 后NMN 的生成量為6.86 g/L （見圖6（d）），控制溶氧水平的結(jié)果明顯高于不控制溶氧水平。 然而，催化反應(yīng)體系中仍有較多的底物NAM 剩余，控制溶氧水平在40%時反應(yīng)20 h 后NAM 剩余量 （質(zhì)量濃度）為6.22 g/L，總反應(yīng)過程NAM 的摩爾轉(zhuǎn)化率為66.28%。

圖6 催化過程控制溶氧水平對合成NMN 的影響Fig. 6 Effects of controlling dissolved oxygen levels during catalytic process on NMN synthesis

2.4.2 全細胞催化過程中底物煙酰胺不同流加方式對合成NMN 的影響 在分批催化反應(yīng)過程中，考慮到底物NAM 有較多的剩余，10.0 g/L 的初始底物質(zhì)量濃度可能對催化過程具有一定抑制作用。 基于此， 通過降低底物NAM 的初始添加量， 考察NAM 的不同流加方式（梯度流速流加、恒定速度流加和多節(jié)點流加）對合成NMN 的影響，過程中為減少葡萄糖效應(yīng)，全細胞催化過程中實時監(jiān)測葡萄糖質(zhì)量濃度，并通過補料方式維持反應(yīng)體系中葡萄糖質(zhì)量濃度在4.0 g/L 左右。 研究發(fā)現(xiàn)，當催化過程以恒定速度流加方式（0～20 h 以0.450 g/（L·h）的流速流加） 補加底物NAM 的效果最好， 反應(yīng)24 h 后NMN 生成量為12.24 g/L，反應(yīng)體系中仍有4.78 g/L的NAM 剩余，底物NAM 摩爾轉(zhuǎn)化率為85.65%（見圖7（a））；以梯度流速流加方式（0～5 h 以0.900 g/（L·h）的流速補加，＞5～10 h 以0.450 g/（L·h）的流速補加，＞10～20 h 以0.225 g/（L·h） 的流速補加）補加底物NAM 的反應(yīng)過程，反應(yīng)24 h 后NMN 生成量為10.59 g/L， 體系中剩余5.42 g/L 的NAM， 底物NAM 摩爾轉(zhuǎn)化率為84.45%（見圖7（b））。 結(jié)果表明，通過補料方式能夠顯著提高全細胞催化反應(yīng)合成NMN 的生成量，相比分批催化反應(yīng)過程，以恒定速度流加方式補加底物NAM 的反應(yīng)過程，NMN 的生成量提高了78.43%，底物NAM 的摩爾轉(zhuǎn)化率提高了29.22%。

圖7 催化過程中底物煙酰胺流加方式對合成NMN 的影響Fig. 7 Effects of different adding modes of nicotinamide during catalytic process on NMN synthesis

3 結(jié) 語

隨著對NMN 在抗衰老和治療神經(jīng)退行性疾病等方面生物學(xué)功能的深入研究，近年來應(yīng)用生物合成法高效合成NMN 已成為研究熱點[23]。研究人員通過代謝工程改造策略， 在大腸桿菌中構(gòu)建了NMN的合成途徑，通過發(fā)酵過程優(yōu)化和全細胞催化等策略，提高了NMN 的合成效率[11，24]。 作者在前期研究構(gòu)建的一株能夠高效合成NMN 的大腸桿菌菌株的基礎(chǔ)上，在搖瓶水平上對菌株培養(yǎng)條件和全細胞催化條件進行了優(yōu)化， 并在5 L 發(fā)酵罐上對催化過程底物NAM 的補料方式進行了優(yōu)化，NMN 的生成量提高至12.24 g/L， 底物NAM 的摩爾轉(zhuǎn)化率為85.65%。 與前期已報道的NMN 全細胞催化合成NMN 相比（6.79 g/L）[16]，本研究中得到的NMN 生成量有明顯提高，底物NAM 的摩爾轉(zhuǎn)化率也接近，但催化時間有所延長。 另外，與作者所在研究團隊前期建立的在發(fā)酵過程中流加底物NAM 的生產(chǎn)工藝相比[17]，本研究中建立的全細胞催化工藝仍需進一步優(yōu)化。 為提高NMN 生成量以滿足工業(yè)化生產(chǎn)需求，后期需要進一步對菌株培養(yǎng)的發(fā)酵條件、全細胞催化過程以及放大工藝等進行系統(tǒng)優(yōu)化。