耐鹽芽孢桿菌R1 高效殼聚糖酶異源表達及特性分析

王建榮， 王永華， 祝木金， 王 平， 陳 微， 余 思， 鐘 斌

（1. 深圳潤康生態環境股份有限公司， 廣東 深圳 518102；2. 華南理工大學食品科學與工程學院， 廣東 廣州 510641；3. 深圳諾普信農化股份有限公司，廣東 深圳 518102）

作為一種生物多糖，幾丁質來源廣泛，據統計，每年自然界產生的幾丁質多達數百億噸[1]。 幾丁質由于溶解性太差，限制其產業化應用。 幾丁質脫去乙酰基團形成的殼聚糖可以溶于稀酸，提升其應用價值，但是黏度高、溶水性差等缺點還是限制其進一步推廣和應用[1]。 殼寡糖作為殼聚糖的降解產物，聚合度一般在2～20，相比于殼聚糖，殼寡糖具有低黏度、良好的水溶性以及生物可降解性等優勢[2]。 研究表明，殼寡糖具有抗炎癥、抗腫瘤、抑菌、抗氧化等功效，因此可廣泛應用于食品、醫藥、綠色農業種植等領域[3-4]。 目前殼寡糖的制備方式可分為化學法、物理法和酶法三大類，相比另外兩種方法，化學法速度快、成本低，因此產業化應用以化學法為主[5]。 隨著對殼寡糖研究的深入，越來越多的研究人員提倡酶法制備殼寡糖， 酶法工藝具有綠色環保、反應過程和產物可控、產物結構完好等優勢[5]。 但是較高的生產成本限制了酶法工藝的推廣應用，因此降低酶法工藝成本，尋找高效殼聚糖酶具有重要意義。

殼聚糖酶能夠分解殼聚糖形成殼寡糖，殼聚糖酶來源廣泛，已報道的殼聚糖酶主要來源于細菌和真菌。 根據蛋白質結構特性，殼聚糖酶可細分為多個家族，其中46 家族殼聚糖酶因具有催化效率高、反應條件溫和等優點，在許多領域具有良好的應用價值[6-7]。46 家族殼聚糖酶主要來源于細菌，迄今，已有多種46 家族殼聚糖酶被分離純化以及特性表征。 來源于芽孢桿菌的殼聚糖酶作為46 家族重要組成部分， 前期的研究主要集中在萎縮芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、莫海威芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌[8-12]，而關于耐鹽芽孢桿菌殼聚糖酶的研究還未有報道。 本研究以前期篩選到的耐鹽芽孢桿菌R1 為研究對象， 通過同源克隆獲得耐鹽芽孢桿菌R1 殼聚糖酶基因（csnbh46），通過畢赤酵母異源表達獲得重組耐鹽芽孢桿菌殼聚糖酶CsnBh46，此外對重組CsnBh46 進行表征分析，為其下一步研究和產業化應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種、質粒以及試劑

耐鹽芽孢桿菌R1（分離自土壤，保存于-60 ℃低溫冰箱）：作者所在實驗室提供；大腸桿菌Top10感受態細胞：寶日醫生物技術（北京）有限公司產品；表達載體pPICZαA、畢赤酵母X33：美國賽默飛世爾科技公司產品。

限制性內切酶Sac I、EcoR I、Not I：寶日醫生物技術（北京）有限公司產品；Ni-IDA 蛋白質純化試劑盒：上海生工股份有限公司產品；殼聚糖、氨基葡萄糖、幾丁質、木聚糖、羧甲基纖維素鈉：上海源葉生物科技有限公司產品；不同聚合度殼寡糖（聚合度2～6）： 惠州長龍生物技術有限公司產品；Silica gel 60 F254 薄層層析硅膠板：德國默克公司產品；其他試劑均為國產分析純。

實驗過程中所用的培養基主要包括LBZ 培養基、YPDZ 培養基、BMGY 培養基、BMMY 培養基和BSM 培養基，所有培養基的配制均參照前期報道方法[13]。

1.2 儀器與設備

PCR 儀：美國應用生物系統（ABI）公司產品；凝膠成像系統、電轉化儀：美國伯樂公司產品；核酸濃度測定儀： 北京百泰克生物技術有限公司產品；7 L發酵罐： 鎮江東方生物工程設備技術公司產品；紫外分光光度計：日本島津公司產品；UltiMate3000 高效液相色譜儀：美國賽默飛世爾科技公司產品。

1.3 方法

1.3.1 耐鹽芽孢桿菌R1 殼聚糖酶基因克隆及分析將前期保藏于-60 ℃冰箱的耐鹽芽孢桿菌R1 取出活化， 以單菌落的形式接入LB 液體培養基進行培養， 吸取50 μL 培養好的菌液，98 ℃熱處理5 min后作為PCR 擴增模板。根據耐鹽芽孢桿菌KKD1 基因組中假定殼聚糖酶基因序列 （基因登錄號：CP054584.1，1 312 385～1 313 226） 設計一對引物（csnbh46-fw：5′-ATGAAAATCAGTTTGGAGAAA-3′和csnbh46-rev：5′-TTATTTGATTACGAAATCACC-3′）用于PCR 擴增。 以處理好的菌液為擴增模板，通過PCR 擴增獲得目標產物，通過瓊脂糖凝膠電泳對目標PCR 產物進行純化回收，將純化回收后的PCR產物送至廣州艾基生物有限公司進行測序分析，根據測序結果獲得殼聚糖酶基因csnbh46。

1.3.2 耐鹽芽孢桿菌殼聚糖酶CsnBh46 序列分析通過NCBI 數據庫完成殼聚糖酶基因csnbh46 序列比對分析；通過expasy 平臺提供的軟件完成殼聚糖酶CsnBh46 理化性質及基礎結構分析；通過在線軟件SignalP-5.0 Server 完成信號肽分析；通過在線軟件SWISS-MODEL 完成殼聚糖酶CsnBh46 三維建模； 通過軟件Autodockviner 完成殼聚糖酶CsnBh46和底物對接分析； 通過軟件PyMOL 分析殼聚糖酶CsnBh46 三維結構。

1.3.3 重組工程菌構建及篩選 由于在畢赤酵母X33 中進行重組表達， 因此根據畢赤酵母密碼子偏好性進行序列優化。 優化后的基因序列 （命名為csnbh46s， 不含信號肽編碼序列） 由通用生物系統（安徽）有限公司合成。合成過程中在csnbh46s 基因序列兩端添加EcoR I 和Not I 酶切位點， 此外去掉csnbh46s 基因序列自身終止密碼子， 將合成的csnbh46s 基因和載體pPICZαA 進行連接反應，獲得表達載體 pPICZαA-csnbh46s。 將表達載體pPICZαA-csnbh46s 用限制性內切酶Sac I 線性化后，轉入畢赤酵母X33 感受態細胞中，將轉化后的畢赤酵母X33 感受態細胞涂布于YPDZ 固體培養基，30 ℃靜置培養。 參照前期報道的方法進行篩選實驗[13]，最終確定1 個重組工程菌進行高密度發酵培養。

1.3.4 高密度發酵 高密度發酵培養在7 L 發酵罐中進行，實驗過程如下：1）將重組工程菌以單菌落形式接入YPDE 培養基中過夜培養（200 r/min、30 ℃），作為一級種子液；2）將一級種子液按1%的接種體積分數接入含有100 mL YPD 培養基的500 mL 搖瓶中，200 r/min、30 ℃培養至OD600nm值達到6～10；3）將培養好的菌液按照10%的接種體積分數接入7 L 發酵罐中進行培養；4）初始階段補加甘油作為碳源供菌體生長，當菌體質量濃度（以菌體濕質量計）增加至181 g/L，停止流加甘油，開始補加甲醇進行誘導培養；5）培養過程中每隔24 h 取樣進行酶活力、總蛋白質質量濃度以及細胞質量濃度的測定，測定過程和前期報道方法一致[8]。

1.3.5 重組CsnBh46 分離純化及酶動力學參數測定重組CsnBh46 純化參照文獻[8]的方法進行。 通過超濾管（相對分子質量1.0×104）對高密度發酵上清液進行濃縮。 以濃縮好的酶液為對象，利用Ni-IDA 蛋白質純化試劑盒獲得純化后重組CsnBh46。 測定重組CsnBh46 對不同質量濃度膠體殼聚糖（1～10 mg/mL）的反應速度，通過軟件GraphPad Prism 8.0.2 擬合分析獲得相關酶動力學參數，如米氏常數Km、最大反應速度vmax等。

1.3.6 重組CsnBh46 特性測定 重組CsnBh46 最適反應pH 測定如下：在55 ℃、不同pH 條件下（pH 3.5～6.0 時為0.05 mol/L 乙酸乙酸鈉緩沖液，pH 6.5～7.0 時為0.05 mol/L 磷酸緩沖液）測定純化后重組CsnBh46 酶活力，參照前期報道方法[8]計算相對酶活力；pH 穩定性測定如下： 將純化后重組CsnBh46 在25 ℃、不同pH 條件下（pH 3.0～11.0）處理4 h 后測定剩余酶活力。 重組CsnBh46 最適反應溫度測定如下：在pH 6.0 條件下，測定純化后重組CsnBh46 在不同溫度（40～70 ℃）的酶活力，參照前期報道方法[8]計算相對酶活力；將純化后重組CsnBh46 在45～60 ℃條件下水浴處理30 min 和60 min 后，測定剩余酶活力。不同金屬離子對純化后重組CsnBh46 穩定性影響參照前期報道方法[8]。 以不同脫乙酰度膠體殼聚糖、幾丁質、羧甲基纖維素鈉、木聚糖為底物，分別測定純化后重組CsnBh46 酶活力，將測得的最高酶活力設置為100%，計算相對酶活力。

1.3.7 重組CsnBh46 水解特性分析 以5 g/dL 不同聚合度殼寡糖（殼二糖至殼六糖）為底物，參照前期報道的方法[8，14]研究重組CsnBh46 水解特性。

1.3.8 不同聚合度殼寡糖可控性制備 以脫乙酰度95%膠體殼聚糖為底物，通過重組CsnBh46 可控性制備不同聚合度殼寡糖。 首先， 摸索不同重組CsnBh46 添加量（5～25 U/mL）對不同質量濃度膠體殼聚糖（1～3 g/dL）的水解效果。 總反應體系為10 mL，在55 ℃、100 r/min 反應1 h 后取樣進行分析。 其中水解率和產物組成測定均參照前期報道方法[15-16]。其次，在55 ℃、100 r/min 條件下，以質量濃度3 g/dL膠體殼聚糖為底物， 重組CsnBh46 添加量為10 U/mL， 解析反應過程中水解率和產物組成動態變化。

2 結果與分析

2.1 殼聚糖酶基因csnbh46 序列分析

結合測序結果以及NCBI 比對分析， 發現csnbh46 基因全長837 bp，編碼278 個氨基酸。通過軟件ProtParam 預測，CsnBh46分子式為C1390H2172N382O426S8，蛋白質相對分子質量為31 300。 NCBIblastp 比對結果顯示CsnBh46 與枯草芽孢桿菌殼聚糖酶（WP_133486751.1）相似性為93.1%，與萎縮芽孢桿菌殼聚糖酶 （WP_088117259.1） 相似性為91.2%。NCBIblastp 比對結果表明CsnBh46 屬于糖苷水解酶46 家族。 將CsnBh46 與已經獲得晶體的殼聚糖酶（包括鏈霉菌174 殼聚糖酶Csn174，P33665.1；鏈霉菌SirexAA-E 殼聚糖酶Csn5457，AEN13266.1；環狀芽孢桿菌殼聚糖酶CsnBac，P33673.2； 枯草芽孢桿菌殼聚糖酶CsnMY002，WP_148982050.1）進行比對分析，實驗結果如圖1 所示。 雖然不同微生物來源的殼聚糖酶氨基酸序列差異性大，但是酶催化活性位點高度保守，根據比對結果以及之前的文獻報道[17]，推測第55 位的谷氨酸和第71 位的天冬氨酸為CsnBh46 催化活性位點。此外，SignalP-5.0 Server 預測CsnBh46 前36 個氨基酸為其潛在信號肽序列。

圖1 殼聚糖酶CsnBh46 與46 家族殼聚糖酶蛋白質比對分析Fig. 1 Protein comparative analysis of chitosanase CsnBh46 and glycoside hydrolase family 46

以枯草芽孢桿菌殼聚糖酶CsnMY002 （PDB 登錄號為7C6C） 為模板， 通過在線軟件SWISSMODEL 建模，獲得CsnBh46 三維構象（見圖2（a））。和已報道的殼聚糖酶一致[18]，CsnBh46 三維結構呈球狀，主要由α 螺旋構成，其中α2～α4 構成上半球；下半球主要有α1、α6～α9 和2 個β 折疊構成； 上下兩個半球由長螺旋α5 連接。 CsnBh46 和殼六糖分子對接由Autodockviner 完成。 由圖2（b）可知，CsnBh46 底物結合區域呈孔洞狀態， 殼六糖被包裹在底物結合區域。 由圖2（c）可知，CsnBh46 底物結合區域與殼六糖之間的作用力主要是氫鍵，其中多個關鍵氨基酸在水解過程中發揮重要作用。

圖2 殼聚糖酶CsnBh46 結構分析Fig. 2 Structure analysis of chitosanase CsnBh46

2.2 重組工程菌構建及篩選

由于在畢赤酵母X33 中進行重組表達，因此選擇畢赤酵母最經典的α 信號肽替代CsnBh46 自身信號肽。 此外通過分析，發現耐鹽芽孢桿菌和畢赤酵母密碼子偏好性存在差異，因此需要根據畢赤酵母密碼子偏好性進行序列優化。 通過密碼子優化，將原始基因csnbh46 的GC 含量由45.1%提升至48.2%， 更接近畢赤酵母高效表達最適范圍 （約50%），密碼子適用指數（CAI）由0.62 提升至0.78，整個過程對179 個堿基進行了優化（見圖3）。 優化后的基因連接至載體pPICZαA， 獲得表達載體pPICZαA-csnbh46s。將表達載體pPICZαA-csnbh46s線性化后轉入畢赤酵母X33 獲得多個重組轉化子。初步篩選挑取96 個轉化子，通過酶活力測定分析，最終選取3 個高酶活力重組工程菌 （分別命名為bh-5、bh-65 和bh-73）進行復篩。 復篩采用搖瓶培養，誘導時間均為120 h，搖瓶復篩結果顯示重組工程菌bh-5 發酵酶活力最高（125 U/mL），其次為bh-73（105 U/mL）和bh-65（101 U/mL）。

圖3 csnbh46 基因密碼子優化序列分析Fig. 3 Sequence analysis of optimized and native gene of csnbh46

2.3 重組工程菌高密度發酵

選取重組工程菌bh-5 進行高密度發酵， 實驗在7 L 發酵罐中進行。 由圖4（a）可知，在誘導培養168 h 后，重組工程菌bh-5 的酶活力、總蛋白質質量濃度和細胞質量濃度均達到最高， 分別為6 375 U/mL、4.3 g/L 和465 g/L。 相比搖瓶培養，重組工程菌bh-5 在7 L 發酵罐發酵后的酶活力提升了50倍。由圖4（b）可知，發酵上清液中存在兩條主要蛋白質條帶，相對分子質量分別約為3.3×104和2.7×104，推測相對分子質量3.3×104條帶是由蛋白質翻譯過程中糖基化形成的。 由圖4（c）可知，重組CsnBh46去糖基化后只剩下一條相對分子質量約為2.7×104的條帶，表明重組CsnBh46 存在糖基化修飾。此外發酵上清液中基本為重組CsnBh46（見圖4（b））。

圖4 重組菌bh-5 在7 L 發酵罐發酵曲線及不同樣品SDS-PAGE 蛋白質電泳Fig. 4 Fermentation curve and SDS-PAGE analysis of different samples of recombinant strain bh-5 cultivated in 7 L bioreactor

2.4 分離純化、酶動力學參數及底物特異性測定

通過實驗獲得純化重組CsnBh46， 純化后的重組CsnBh46 酶比活為2 310 U/mg，重組CsnBh46 酶反應動力學參數如表1 所示。重組CsnBh46 米氏常數Km為0.75 mg/mL， 表明重組CsnBh46 對殼聚糖具有良好的親和力。 最大反應速度vmax為2 513 μmol/（L·min·mg）， 表明重組CsnBh46 能夠高效水解殼聚糖。

表1 重組CsnBh46 酶動力學參數Table 1 Kinetic parameters of recombinant CsnBh46

2.5 溫度特性

重組CsnBh46 溫度特性如圖5 所示，由圖5（a）可知，重組CsnBh46 最適反應溫度為60 ℃，在50～65 ℃時相對酶活力均大于80%。 由圖5（b）可知，重組CsnBh46 在45～55 ℃時具有良好的穩定性，水浴處理1 h 后，剩余酶活力均大于80%，當處理溫度大于55 ℃，剩余酶活力急劇下降，重組CsnBh46 在60 ℃水浴處理1 h 后，剩余酶活力僅為11%。 有研究報道萎縮芽孢桿菌殼聚糖酶Csn-SH[18]、解淀粉芽孢桿菌殼聚糖酶BaCsn46A[15]和BaCsn46B[11]，在55 ℃熱處理30 min 后， 剩余酶活力分別為7%、31%和60%。 相比于上述芽孢桿菌殼聚糖酶， 重組CsnBh46 具有更好的熱穩定性。

圖5 溫度對重組CsnBh46 的影響Fig. 5 Effect of temperature on recombinant CsnBh46

2.6 pH 特性

重組CsnBh46 的pH 特性如圖6 所示， 由圖6（a）可知，重組CsnBh46 最適反應pH 為6.0。 由圖6（b）可知，重組CsnBh46 在pH 6.0～8.0 時具有良好的穩定性， 室溫放置4 h 后， 剩余酶活力均大于80%。 重組CsnBh46 的pH 特性與已報道的吉氏菌殼聚糖酶相似[19]。

圖6 重組CsnBh46 最適反應pH 和pH 穩定性Fig. 6 Optimal reaction pH and pH stability of recombinant CsnBh46

2.7 金屬離子特性

不同金屬離子對重組CsnBh46 穩定性影響如表2 所示。 Mn2+、Mg2+和Ca2+對重組CsnBh46 具有激活作用， 其中Mn2+效果最好。 在1 mmol/L 條件下，Mn2+、Mg2+和Ca2+處理組剩余酶活力分別為145.2%、111.5%和115.5%；在5 mmol/L 條件下，Mn2+、Mg2+和Ca2+處理組剩余酶活力分別為164.8%、118.6%和123.2%。 金屬離子Cu2+、Fe2+和Co2+對重組CsnBh46具有抑制作用，其中Fe2+的影響最大。當離子濃度為1 mmol/L 和5 mmol/L 時，Fe2+處理組的剩余酶活力分別僅為26.6%和8.5%。

表2 不同金屬離子對重組CsnBh46 穩定性影響Table 2 Effects of different metal ions on the stability of recombinant CsnBh46

2.8 底物特異性

重組CsnBh46 底物特異性如表3 所示， 重組CsnBh46 只對膠體殼聚糖具有水解活性， 其中對脫乙酰度95%膠體殼聚糖表現出最高水解活性。 重組CsnBh46 對粉末幾丁質、膠體幾丁質、羧甲基纖維素鈉以及木聚糖均沒有活性。

表3 重組CsnBh46 底物特異性Table 3 Substrate specificity of recombinant CsnBh46

2.9 水解特性

重組CsnBh46 水解不同聚合度殼寡糖實驗結果如圖7 所示，重組CsnBh46 對殼二糖和殼三糖沒有水解活性，反應2 h 后，殼二糖和殼三糖均沒有被分解成更小的糖。 重組CsnBh46 對殼四糖水解活性較弱，反應2 h 后，少量殼四糖被轉化為殼二糖。 重組CsnBh46 對殼五糖和殼六糖具有良好的水解活性， 反應1 h 后， 殼五糖全部轉化為殼二糖和殼三糖，殼六糖則全部轉化為殼二糖、殼三糖和殼四糖。在所有的反應過程中均沒有出現單糖， 表明重組CsnBh46 是一種內切殼聚糖酶。此外，在所有的反應體系中均沒有出現比初始底物聚合度更高的殼寡糖，表明重組CsnBh46 不具有轉糖苷酶活性。

圖7 重組CsnBh46 水解不同聚合度殼寡糖產物分析Fig. 7 Analysis of the hydrolysis products from differently polymerized chitosan oligosaccharides hydrolyzed by recombinant CsnBh46

2.10 重組CsnBh46 水解殼聚糖制備不同聚合度殼寡糖

不同酶添加量對不同質量濃度（1～3 g/dL）底物的水解效果如圖8 所示。底物質量濃度為1 g/dL、酶添加量在5～20 U/mL 時，反應1 h 后，水解產物主要由殼二糖和殼三糖構成，含有少量殼四糖；當酶添加量為25 U/mL 時，水解產物則基本為殼二糖和殼三糖（見圖8（a））。 底物質量濃度2 g/dL 和3 g/dL的水解結果相似， 當酶添加量為5～10 U/mL 時，水解產物主要為殼二糖、殼三糖、殼四糖和殼五糖，包含少量殼六糖；當酶添加量大于10 U/mL，水解產物則主要由殼二糖、殼三糖和殼四糖構成（見圖8（b）和圖8（c））。

圖8 重組CsnBh46 水解不同質量濃度膠體殼聚糖產物TLC 分析Fig. 8 TLC analysis of products from different concentration of colloidal chitosan catalyzed by recombinant CsnBh46

根據不同酶添加量水解不同質量濃度膠體殼聚糖實驗結果，進一步研究10 U/mL 酶添加量水解3 g/dL 膠體殼聚糖反應過程中產物組成和水解率，實驗結果如圖9 所示。 反應15 min 后，水解產物由殼二糖至殼六糖構成（見圖9（a）），其中殼三糖、殼四糖、 殼五糖和殼六糖的質量濃度分別為6.32、7.12、6.51、5.32 mg/mL（見圖9（b）），水解率達到92.5%（見圖9（c））。 反應30 min 后，殼五糖和殼六糖的質量濃度逐漸降低，殼二糖、殼三糖和殼四糖的質量濃度以及水解率逐漸增加（見圖9）。 反應至45 min 和60 min 時，水解產物主要由殼二糖、殼三糖、殼四糖和殼五糖構成。

圖9 不同反應時間下重組CsnBh46 水解3 g/dL 膠體殼聚糖的水解產物TLC 分析、殼寡糖質量濃度以及水解率Fig. 9 TLC analysis of products, mass concentration of chitosan digosaccharides and hydrolysis rate of 3 g/dL colloidal chitosan hydrolyzed under different reaction time by recombinant CsnBh46

迄今，已有多種酶用于制備殼寡糖，根據酶的種類可以分為專一性酶（殼聚糖酶）和非專一性酶（包括果膠酶、纖維素酶、脂肪酶等）。 由表4 可知，殼聚糖酶水解效率明顯優于非專一性酶，此外重組CsnBh46 水解效率優于已報道的多種殼聚糖酶。

表4 酶法制備殼寡糖Table 4 Chitosan oligosaccharides prepared by enzymatic methods

3 結 語

通過同源克隆獲得耐鹽芽孢桿菌R1 殼聚糖酶基因csnbh46，該基因全長為837 bp，編碼278 個氨基酸，其中前36 個氨基酸為其潛在信號肽序列，序列比對結果表明殼聚糖酶CsnBh46 屬于糖苷水解酶46 家族。 以畢赤酵母X33 為宿主，重組表達殼聚糖酶CsnBh46， 在7 L 發酵罐條件下， 重組工程菌bh-5 最高酶活力為6 375 U/mL。此外通過蛋白質純化以及酶動力學參數測定發現重組CsnBh46 米氏常數Km為0.75 mg/mL，最大反應速度vmax為2 513 μmol/（L·min·mg）， 表明重組CsnBh46 對殼聚糖具有良好的親和力和水解活性。重組CsnBh46 在45 ～55 ℃具有良好的活性和穩定性。重組CsnBh46 水解特性表明其是一種內切殼聚糖酶。 重組CsnBh46 能夠高效水解3 g/dL 膠體殼聚糖， 酶添加量10 U/mL條件下， 反應15 min 殼聚糖水解率便達到92.5%，表明重組CsnBh46 適用于殼寡糖的酶法制備，為CsnBh46 下一步產業化應用奠定基礎。