推拿對膝關節骨關節炎模型大鼠膝關節軟骨白細胞介素-1β、白細胞介素-6、腫瘤壞死因子受體相關因子6、細胞核因子信使核糖核酸攜帶遺傳信息及蛋白的影響

羅 翱，余 敏*，杜曜宇，郭 嘯，喻溢楠

（1.重慶市北碚區中醫院，重慶 400700；2.重慶醫科大學中醫藥學院，重慶 401331）

膝關節骨關節炎（knee osteoarthritis，KOA）是一種以關節周圍骨增生為主要表現的關節疾病，其特征是膝關節軟骨退行性變化導致軟骨丟失和破壞[1]。常伴有關節滑膜繼發性炎癥病變，又稱退行性關節炎、增殖性關節炎和老年性關節炎等，臨床表現為關節疼痛、絞殺、功能障礙[2-3]。目前，對于KOA 患者，臨床上主要采用藥物治療為主，非藥物治療為輔的治療原則[4]。然而，有研究顯示，西醫常規治療KOA 療效不佳，藥物副作用顯著，例如，廣泛使用非甾體抗炎藥和糖皮質激素有許多副作用，影響患者的依從性，從而影響其實際療效[5]。因此，尋求一種經濟、環保、適用范圍廣、易于操作、接受度高的非藥物治療方法對KOA 患者來說是非常緊迫的[6]。基于此，本實驗通過選擇12 周齡雄性美國斯潑累格·多雷（SD）大鼠27 只，通過動物實驗，分析推拿對膝骨性關節炎可能的生物學機制，現做出如下闡述。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇12 周齡雄性SD 大鼠27 只，體質量400～450 g，由重慶醫科大學實驗動物中心提供，采用隨機數字表法選取9 只作為正常對照組（n=9），余下18只II 型膠原酶誘導建立KOA 大鼠模型，再利用隨機數字表將其分為自然恢復組（n=9）和推拿手法治療組（n=9），正常對照組于造模前一天取標本；自然恢復組正常喂養并于第1 次造模后4 周處死大鼠取標本。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的制備 將Ⅱ型膠原蛋白酶注入SD 大鼠膝關節腔內，1 周后鏡下觀察，關節組織有早期KOA 樣改變說明大鼠KOA 模型制備成功。實驗選用美國Sigma 公司Ⅱ型膠原蛋白酶，用無菌生理鹽水將膠原蛋白酶粉末溶解配成濃度為0.02 mg/50 μL（≥25 CDU/50 μL）的溶液備用。實驗步驟：①將大鼠稱重，用新鮮配置的質量濃度為2%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉大鼠；②將雙側膝關節用碘伏消毒3 次；③用1 mL 注射器行右膝關節穿刺，回抽未見血液回流后將50 μL 配置好的膠原蛋白酶注入關節腔內；④退針后予碘伏棉簽按壓擦洗傷口，并用敷帖覆蓋傷口，術后不給予其他特殊處理。

1.2.2 飼養環境 飼養室的消毒隔離工作是管理中重要的一環，必須引起高度重視，其是保持大鼠等級的關鍵。飼養員進入飼養室前必須更衣，以肥皂水洗手并用清水沖洗干凈，戴上消毒過的口罩、帽子、手套后方可進入；飼養室內保持整潔，門窗、墻壁、地面、鼠盒、架子每天擦洗；每周二、周五用0.1%新潔爾滅或其他消毒劑消毒，隔周更換消毒劑品種，每月進行1 次大消毒，用0.1%過氧乙酸噴霧消毒效果較好。

1.2.3 干預措施 ①2%戊比妥鈉（上海新亞藥業有限公司，國藥準字H31021725，規格：0.1 g）注射麻醉造模成功后待干預大鼠（40 mg/kg）。②肌群推拿法：將大鼠仰臥位，造模側腘窩部墊少量棉花使膝關節微屈，術者立于患側，針對大腿及小腿肌群采用推、揉、點等方法推揉相關肌肉群，強化肌肉力量。包括大鼠大腿的股四頭肌、股二頭肌、半腱肌、大收肌、縫降肌和小腿的腓腸肌、腓骨長肌、脛骨前肌等，施術約3 min；③肌腱、韌帶彈撥法：術者以大拇指指腹彈、撥、揉相關肌腱及韌帶：重點為②中所述肌群在膝關節附近的肌腱及膝關節兩側副韌帶、冠狀韌帶，時間約2 min。④揉髕法：術者以拇食二指按住髕骨，以較輕手法按揉髕骨1 min。⑤手指點穴法：點按大鼠梁丘、血海、陰陵泉、陽陵泉、委中、三陰交、足三里每穴各5 次。⑥關節牽引、旋轉法：將大鼠側臥，90°屈膝患肢，術者右手握緊大鼠小腿近踝端，左手抵住大鼠大腿遠端近腘窩處，術者雙手相向用力牽引大鼠膝關節，并做順時針和逆時針小幅度旋搖膝關節，施術約1 min。⑦放松手法：術者在其膝關節周圍采用雙指疊擦法，以透熱為度，時長1 min，結束手法。1 次/d。

1.3 觀察指標①比較造模4 周后3 組大鼠的IL-1β、IL-6、TRAF6、NF-κBp65 mRNA 相對表達量；②比較造模4 周后3 組大鼠的IL-1β、IL-6、TRAF6、NF-κBp65 蛋白表達水平。

表1 3 組大鼠的IL-1β、IL-6、TRAF6、NF-κBp65 mRNA 相對表達量比較（±s）

表1 3 組大鼠的IL-1β、IL-6、TRAF6、NF-κBp65 mRNA 相對表達量比較（±s）

IL-1β：白細胞介素-1β；IL-6：白細胞介素-6；TRAF6：腫瘤壞死因子受體相關因子6；NF-κBp65：細胞核因子；mRNA：信使核糖核酸攜帶遺傳信息。

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表2 3 組大鼠的IL-1β、IL-6、TRAF6、NF-κBp65 蛋白的水平比較（pg/mL，±s）

表2 3 組大鼠的IL-1β、IL-6、TRAF6、NF-κBp65 蛋白的水平比較（pg/mL，±s）

IL-1β：白介素-1β；IL-6：白介素-6；TRAF6：腫瘤壞死因子受體相關因子6；NF-κBp65：細胞核因子。

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IL-1β、IL-6、TRAF6 的檢測方法：開放大鼠左冠狀動脈前降支，從右外靜脈通道采集2 mL 血液，3 000 r/min 速度離心10 min，使用雙抗體夾心法結合酶標儀（上海閃譜生物科技公司，型號：SuPerMax 3100）對上述指標的相對表達量進行測定。

NF-κBp65 的檢測方法：將樣品在SDS-PAGE中進行電泳分離，使用半干式電印記法將轉移凝膠上蛋白，使用5%脫脂乳進行封閉90 min，再洗滌3 次，每次持續10～15 min，在一抗工作液中孵育90 min，通過ECL 顯色法，將β-actin蛋白作為內參蛋白，使用Imagine-J 分析蛋白灰度比值，表示目的蛋白的相對表達量。

1.4 統計學分析采用SPSS20.0 統計學軟件，其中計量資料用（±s）來表示，通過F值進行驗算，P＜0.05 代表差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3 組大鼠的I L-1 β、I L-6、T R A F 6、N FκBp65 mRNA 相對表達量比較正常對照組大鼠的IL-1β、IL-6、TRAF6、NF-kBp65mRNA 相對表達量低于推拿手法治療組和自然恢復組（P＜0.05），推拿手法治療組的IL-1β、IL-6、TRAF6、NF-κBp65 相對表達量低于自然恢復組（P＜0.05），見表1。

2.23 組大鼠的IL-1β、IL-6、TRAF6、NF-κBp65 蛋白的水平比較正常對照組大鼠的IL-1β、IL-6、TRAF6、NF-kBp65 蛋白水平低于推拿手法治療組和自然恢復組（P＜0.05），推拿手法治療組的IL-1β、IL-6、TRAF6、NFκBp65 蛋白水平低于自然恢復組（P＜0.05），見表2。

3 討論

隨著臨床中對Toll 樣受體4（TLR4）的研究逐漸深入，KOA 患者組織中的TLR4 水平的變化情況受到廣泛關注。TLR4 屬于Toll 樣受體（TLRs）家族中的一員，其屬于Ⅰ型跨膜蛋白受體，被激活后，能夠引發較為強烈的免疫反應，在天然免疫以及炎癥反應中作用明顯[7]。當TLR4 受到激活之后，其能夠經過下游的髓樣分化因子（MyD88）依賴性信號轉導通路使各種炎癥因子被激活[8]。MyD88被激活之后，TLR4 可以結合MyD88 Toll 結構，形成串級聯反應，然后和TRAF6 相結合，使IkB 激酶復合體被激活[9]。

TRAF6 和許多條滑膜組織的炎癥信號通路的活化具有密切聯系，其能夠對炎癥因子的形成以及釋放產生調節作用，和破骨細胞的分化、存活以及骨重吸收具有密切聯系，并與骨代謝過程、細胞凋亡進程以及應激反應形成過程具有密切聯系[10]。本文發現：正常對照組的IL-1β、IL-6、TRAF6、NF-kBP65mRNA 及蛋白相對表達量均低于推拿手法治療組和自然恢復組（P＜0.05），推拿手法治療組的IL-1β、IL-6、TRAF6、NF-κBp65mRNA 及蛋白相對表達量均低于自然恢復組（P＜0.05），說明KOA 大鼠和正常大鼠相比，上述指標mRNA 以及蛋白表達水平處于高表達狀態下，和膝骨性關節炎的發生具有一定聯系。NF-kB 和炎癥反應、免疫調節、腫瘤形成以及細胞凋亡具有密切關聯，從表1 以及表2 中可以發現，膝骨性關節炎大鼠滑膜中的上述指標水平均有所提升，說明該因子的水平和膝骨性關節炎的發生具有一定關聯[11]，采用推拿治療，可將IL-1β、IL-6、TRAF6、NF-κBp65mRNA 以及蛋白水平改善，從而減輕炎性因子水平。

傳統中醫理論認為，推拿是具有疏通經絡、推行氣血、扶正祛邪、調和陰陽的一種治病防病的養生術。推拿在本質上是屬于以“機械力”為特征，通過作用于局部產生生物力學效應，改善局部組織細胞生化環境，調節循環、神經及內分泌等系統狀態的一種物理方法，本文研究結果證明了其效果。

綜上所述，推拿可將膝骨性關節炎大鼠滑膜組織的IL-1β、IL-6、TRAF6、NF-κBp65 mRNA 以及蛋白水平表達量明顯改善，發揮消炎止痛效果，從而預防膝骨性關節炎，值得臨床參考。