互花米草黃酮提取物對肉雞免疫功能的影響

孫秋艷，王彩霞，孫 霞，祈根兄，張興娟，宋莎莎，袁東芳，李叢叢

（山東畜牧獸醫職業學院/山東省畜禽抗菌藥物使用減量化工程技術研究中心，山東 濰坊 261061）

互花米草作為保灘護岸、改良土壤、綠化海灘、改善海灘生態的植被[1]，由于其莖干密集粗壯、地下根莖發達，過度繁殖嚴重影響了海洋航運、沿海灘涂養殖，破壞了沿海濕地生態系統和生物多樣性的維持[2-3]。人們一直在探索改善現狀的經濟有效的防控措施，但就目前的研究和實踐來看，徹底防控的希望幾乎渺茫，因此從合理開發利用資源這一角度探討互花米草防治策略變得十分必要[4]。國內外研究發現，互花米草含有多種維生素和礦物質，尤其是黃酮類化合物含量較高，黃酮類化合物具有抗炎、降糖、降血脂、增強免疫等功效[5-6]。因此，將互花米草黃酮提取物高值化應用到現代畜牧業，將會帶來生態和經濟雙重效益。目前，互花米草黃酮提取物對肉雞免疫功能影響鮮有報道。為了探究互花米草黃酮提取物對肉雞免疫效果的影響，本試驗以AA 白羽肉雞為實驗動物，飼喂添加互花米草黃酮提取物的基礎日糧，連續飼喂7 d，各組在7 d 點眼滴鼻、20 d 飲水免疫1 頭羽份的ND La Sota+IB H120 二聯活疫苗，通過檢測血清中ND-Ab、IBAb、IgM、IgG、IgA、IFN-γ、IL-2、CD4+、CD8+含量和外周血中淋巴細胞轉化率來評價免疫增強效果，為提高肉雞健康水平和綠色養殖提供依據，為國家治理互花米草提供全新方案。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 疫苗 雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯活疫苗（La Sota 株+H120 株）購自上海海利生物技術股份有限公司[批準文號：獸藥生字（2010）090202038]。

1.1.2 主要試劑 雞新城疫抗體（Newcastle disease antibody，ND-Ab）血凝抑制（Hemagglutination inhibition，HI）試驗用抗原（生產批號：10132101）、陽性血清（生產批號：10152101）與陰性血清（生產批號：10142101）購自青島立見診斷技術發展中心；雞 IgM（生產批號：F4554-A）、IgG（生產批號：F4555-A）、IgA（生產批號：F4658-A）、雞傳染性支氣管炎抗體（Infectious Bronchitis antibody，IB-Ab；生產批號：Trx4333-A）、IFN-γ（生產批號：F4564-A）、IL-2（生產批號：F4573-A）、T 淋巴細胞CD4 亞群（生產批號：F8182-A）、T 淋巴細胞CD8 亞群（生產批號：F8185-A）酶聯免疫分析試驗試劑盒購自上海泛柯實業有限公司。

1.1.3 互花米草黃酮提取物制備 新鮮互花米草9 月份采自昌邑市膠萊河入海口海道內，清洗干凈，37 ℃烤箱烘烤，超微粉碎機粉碎晾干后采用醇提法提取黃酮。以蘆丁為標準參照物，用NaNO2-Al（NO3）3法測定互花米草粗提物中黃酮的含量。提取的黃酮提取物高壓滅菌，-20 ℃保存備用。

1.1.4 試驗動物 120 只1 日齡AA 白羽肉雞購自山東亞太中慧集團有限公司，隨機分成4 組，每組30 只。I～III 組分別在基礎日糧中添加互花米草黃酮提取物，添加劑量分別為 1、1.5、2 g/kg，IV 組為飼喂基礎日糧對照組（CG），自1 d 開始，連續飼喂7 d。各組于7 d 點眼滴鼻、20 d 飲水免疫1 頭羽份的新城疫、雞傳染性支氣管炎二聯活疫苗（ND La Sota+IB H120 株）。分別于7、14、21、28、35、42 d 從每組隨機抽取5 只雞，檢測前禁食禁水6 h，進行相關指標檢測。試驗期間所用雞均在山東畜牧獸醫職業學院籠養雞房嚴格按照籠養雞飼養管理要求進行飼養。

1.2 方法

1.2.1 血清采集 無菌采集雞3.0 mL 心臟血注入離心管中，22 ℃，4 000 r/min 離心25 min，取上清，-20 ℃保存備用。

1.2.2 血清中ND-Ab 效價的測定 采用中華人民共和國國家標準（GB/T 16550-2020）中的血凝抑制試驗（HI）進行ND 抗體滴度的檢測，記錄結果為nlog2。

1.2.3 血清中IB-Ab 效價的測定 按照IB-Ab ELISA 試驗盒操作步驟進行檢測，450 nm 波長處測定OD 值，按照試劑盒結果判斷標準判斷陰陽性。

1.2.4 血清中IgM、IgG、IgA、IB-Ab、IFN-γ、IL-2、CD4+、CD8+含量的測定 均按照各試驗盒操作步驟進行測定。

1.2.5 外周血淋巴細胞轉化率的測定 EDTA-Na真空無菌采血管采雞1 mL 心臟抗凝血，加入1 mL 的無血清RPMI-1640 稀釋，輕輕搖勻，加入4 mL 人的淋巴細胞分離液（密度為1.085），20 ℃，2 000 r/min 離心20 min，將黃白色霧狀淋巴細胞層吸出，加入到含有1 mL RPMI-1640 培養液中，20 ℃，2 000 r/min 離心20 min，棄上清，同上離心2 次，棄上清；沉淀細胞加入含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養液懸浮，取一滴細胞懸液計數，將細胞懸液稀釋至2×106個/mL；然后將淋巴細胞懸液接種至96 孔細胞培養板上，0.1 mL/孔，每個樣品重復4 孔，其中3 孔加入終濃度為50 μg/mL 的刀豆蛋白（ConA），另1 孔做陰性對照，置37 ℃，體積分數為5%的CO2培養箱中待淋巴細胞長至單層取出；每孔加5 mg/L的MTT 溶液30 μL，繼續培養4 h，輕輕將上清液棄去，每孔加 DMSO 溶液 200 μL，振蕩10 min，用酶標儀檢測490 nm 下的吸光度值，根據公式LTR=ODconA 刺激/OD 對照組×100%進行淋巴細胞轉化率的計算。

1.2.6 數據分析 利用SPSS Statistics 19.0 統計分析軟件進行數據分析，多重比較用LSD 法進行，試驗數據用平均值±標準差（Mean±SD）并進行顯著性比較。

2 結果

2.1 黃酮提取物的含量

按照方法中所述醇提法提取黃酮，以蘆丁為標準參照物，用NaNO2-Al（NO3）3法測定所提取的黃酮提取物含量為37.2%。

2.2 血清中ND-Ab 效價的變化

各組血清中ND-Ab 效價變化見圖1。結果顯示，I～III 組血清中ND-Ab 效價顯著高于IV 組（P＜0.05）；II 組血清中ND-Ab 效價顯著高于IV組（P＜0.01），顯著高于I 和III 組（P＜0.05）；III組血清中ND-Ab 效價顯著高于I 組（P＜0.05）；各組血清中ND-Ab 效價均在雞日齡28 d 達到高峰，隨后逐漸下降。

圖1 血清中ND-Ab 效價的變化

2.3 血清中IB-Ab 效價的變化

各組血清中IB-Ab 效價變化見表1。結果顯示，所有組IB-Ab OD 值大于0.21，均為陽性。II 組血清中 IB-Ab 效價顯著高于IV 組（P＜0.01），顯著高于I 和III 組（P＜0.05）；II、III 組血清中IB-Ab 顯著高于IV 組（P＜0.05）；III 組血清中IB-Ab 效價顯著高于I 組（P＜0.05）；各組血清中IB-Ab 效價均在雞日齡28 d 達到高峰。

表1 血清中IB-Ab 效價的變化（判斷標準：陰性＜0.21，陽性＞0.21）

2.4 血清中IgM、IgG、IgA、CD4+、CD8+含量的變化

各組血清中IgM、IgG、IgA、CD4+、CD8+含量結果顯示，I～III 組血清中 IgM、IgG、IgA、CD4+、CD+8 含量顯著高于 IV 組（P＜0.05）；II 組血清中IgM、IgG、IgA、CD4+、CD8+含量顯著高于IV 組（P＜0.05）；III 組血清中IgM、IgG、IgA、CD4+、CD8+含量顯著高于I組（P＜0.05）；各組血清中 IgM、IgG、IgA、CD4+、CD8+含量在28 d 后達到高峰，見表2。

表2 血清中IgM、IgG、IgA、CD4+、CD8+含量的變化

2.5 外周血中IL-2、IFN-γ 含量的變化

各組外周血中IL-2、IFN-γ 含量的變化見表3。結果顯示，II 組外周血中IL-2、IFN-γ 含量顯著高于其他各組（P＜0.05）；IV 組外周血中IL-2、IFN-γ 含量顯著低于其他各組（P＜0.05）；III組外周血中外周血中IL-2、IFN-γ 含量顯著高于I組（P＜0.05）；所有組外周血中IL-2、IFN-γ 含量均在28 d 達到高峰，然后開始下降。

表3 外周血中IL-2、IFN-γ 含量的變化

2.6 外周血淋巴細胞轉化率的變化

各組外周血淋巴細胞轉化率的變化見表4。結果顯示，II 組外周血淋巴細胞轉化率顯著高于其他各組（P＜0.05）；IV 組外周血淋巴細胞轉化率顯著低于其他各組（P＜0.05）；III 組外周血淋巴細胞轉化率顯著高于I 組（P＜0.05）；各組外周血淋巴細胞轉化率在28 d 達到高峰。

表4 外周血淋巴細胞轉化率的變化（%）

3 討論與結論

機體血清抗體效價的變化能夠準確、直觀地反映體液免疫的狀態[7]，日糧中添加互花米草黃酮提取物試驗組的血清中ND-Ab、IB-Ab 效價顯著高于空白對照組，可見日糧中添加互花米草黃酮提取物可提高機體的體液免疫水平。

血清免疫球蛋白在機體體液免疫中起到非常重要的作用[8]，IgG、IgM、IgA 代表血清中的免疫球蛋白的水平，含量越高說明機體體液免疫功能越強。禽類血清中IgG 含量遠高于其它免疫球蛋白，且維持時間長，直接參與體液免疫反應，是機體抗感染免疫的主力；IgM 是初次體液免疫反應產生的重要免疫球蛋白，一般僅存在于血液內，起抗原受體作用；IgA 能凝集顆粒性抗原、中和病毒，是腸道、呼吸道、泌尿生殖道等黏膜抗感染免疫的主力。T 淋巴細胞CD4 亞群作為Th 細胞，可刺激B細胞的分化和抗體的生成，CD8 亞群為Tc 細胞，在Th 細胞的輔助下可殺死或溶解靶細胞，因此CD4+和CD8+含量反映T細胞活性，對免疫功能的判斷有著重要作用。日糧中添加互花米草黃酮提取物的各組雞血清中IgG、IgM、IgA、CD4+、CD8+含量顯著高于空白對照組，可見日糧中添加互花米草黃酮提取物可提高雞體體液免疫和細胞免疫水平。

IL-2 能刺激T 輔助細胞、自然殺傷細胞產生細胞因子，并促進細胞因子的繁殖以及刺激T 細胞在體外生長等功能，含量可間接反映機體的免疫水平[9]。IFN-γ 可促進輔助T 淋巴細胞（Th）分化生成Th1，抑制Th2 的生成，對機體進行免疫干預，實現免疫系統防御功能；可刺激自然殺傷細胞并增強其殺傷功能，有利于機體清除病毒感染；可直接促進細胞毒T 淋巴細胞成熟，刺激B 細胞分泌抗體，從而增強機體免疫功能，因此IFN-γ 含量可反映機體免疫水平[10]。日糧中添加互花米草黃酮提取物的各組外周血中IL-2、IFNγ 含量顯著高于空白對照組，可見日糧中添加互花米草黃酮提取物可提高雞體免疫水平。

血液淋巴細胞在機體的免疫應答中具有重要的作用，是反映細胞免疫的指標[11]。本研究發現，日糧中添加互花米草黃酮提取物的各組淋巴細胞轉化率都顯著高于空白對照組，可見日糧中添加互花米草黃酮提取物可以提高雞體的細胞免疫水平。

在雞生長日糧中添加互花米草黃酮提取物可顯著提高雞的免疫功能，本試驗條件下，互花米草黃酮提取物添加劑量為1.5 g/kg 效果最佳。