老年阿爾茨海默病患者血清中TNF-α、M-CSF及miR-181a的表達水平及臨床應用價值

付 丹,梁洪波,孫東鵬,李 斌

(1.江蘇省徐州市東方人民醫院老年精神科,江蘇 徐州 221000;2.江蘇省徐州市東方人民醫院心理科,江蘇 徐州 221000;3.江蘇省徐州市東方人民醫院精神科,江蘇 徐州 221000)

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)是常見的中樞神經系統退行性疾病,不僅影響患者身體健康及生活質量,還給患者及家庭帶來沉重的經濟負擔[1]。AD的發病機制尚不明確,目前認為其發生與基因(如淀粉樣前體蛋白基因突變等)和環境因素(如生活習慣、慢性病等)有關[2]。深入研究影響AD發生的因素,尋找早期診斷AD的血清生物標志物,對AD的早期診治具有重要意義。研究表明,AD的發生發展過程中涉及多種炎癥細胞及炎癥介質如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、巨噬細胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor,M-CSF)等的大量分泌[3]。TNF-α、M-CSF作為具有廣泛生物活性的細胞因子,參與炎癥和免疫應答的調控,但過度分泌時會導致炎癥平衡失調,造成神經元組織的損傷,參與AD的發生發展[4-5]。微小RNA(microRNA, miR)是長度為20～24 nt的調控因子,研究表明,miR-181a通過海馬及杏仁核α-氨基羥甲基惡唑丙酸受體調控突觸可塑性,促進β淀粉樣蛋白(Amyloid-beta peptide,Aβ)誘導的神經炎癥反應,影響AD的發生發展過程,可作為AD早期診斷的分子標志物[6-7]。本研究觀察AD患者血清TNF-α、M-CSF及miR-181a表達,探討三者的臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取自2017年1月—2019年1月期間我院診治的140例AD患者為研究對象(AD組),男性55例,女性85例;年齡58～80歲,平均(70.15±7.27)歲;病程l～8年,平均病程(5.36±1.52)年。并根據臨床癡呆量表評分[8],將AD組分為輕度組(1分)52例,中度組(2分)49例,重度組(3分)39例。病例納入標準:①結合患者臨床癥狀,體格檢查及腦CT等檢查,采用美國精神病學、語言障礙和卒中-老年癡呆和相關疾病學會制定的標準明確AD診斷;②臨床資料完整;③患者家屬對本研究知情同意并簽字。排除標準:①血管性癡呆;②伴有抑郁,精神分裂癥等精神障礙;③近3個月有急性炎癥性疾病,代謝性疾病病史。以同期健康查體的50例健康者為對照組,男性25例,女性25例;年齡59～79歲,平均(68.58±6.25)歲。

本研究經醫院倫理審核批準通過。

1.2方法

1.2.1采用實時熒光定量PCR法檢測 血清miR-181a相對表達量留取AD組入院后即刻藥物治療前,對照組健康體檢時清晨空腹靜脈血5 mL,4 ℃、5 000 r/min離心5 min,取上層血清-80 ℃保存。應用Trizol試劑提取血清總RNA,應用Nanodrop 2 000c分光光度計 (美國,賽默飛公司)檢測RNA濃度,OD260/OD280比值介于1.8～2.0。將總RNA反轉錄為cDNA,然后進行實時熒光定量PCR。miR-181a及內參U6引物序列由華大公司設計合成,miR-181a上游序列為5′-ACACTCCAGCTGGGAACATTCAACGCTGTC-3′,下游序列為5′-GTGTCGTGGAGTCGGCAA-TTC-3′;U6上游序列為5′-CTCGCTTCGGCAG-CACATA-3′,下游序列為5′-AACGATTCA-CGAATTTGCGT-3′。總體系:MasterMIX 5 μL,上、下游引物各0.5 μL,模板cDNA 1 μL,雙蒸水補足至3 μL。條件:95 ℃ 2 min,95 ℃變性15 s,60 ℃退火 30 s,70 ℃延伸30 s,變性退火延伸共35個循環。采用2-△△CT法計算miR-181a的相對表達量。

1.2.2血清TNF-α、M-CSF水平檢測 采用酶聯免疫吸附實驗檢測血清TNF-α、M-CSF水平,試劑盒購自上海江萊生物公司,實驗步驟嚴格按試劑盒說明書進行。簡要步驟:微量反應板每孔加入標本50 μL。每孔加酶結合物50 μL,充分混勻,封板,37 ℃恒溫箱中孵育30 min。洗滌液100 μL注滿各孔洗滌5次。每孔加顯色劑A液、B液各50 μL,充分混勻,封板,置37 ℃恒溫箱孵育15 min。加終止液50 μL,充分混勻。用酶標儀讀數,取波長450 nm,讀取各孔OD值。根據標準品濃度的OD值,對應計算每孔樣品的濃度值。

1.3統計學方法 應用SPSS 22.0統計軟件進行數據分析。計量資料2組間比較采用t檢驗、F檢驗和SNK-q檢驗。計數資料比較采用χ2檢驗。Pearson相關分析AD患者血清TNF-α、M-CSF及miR-181a表達的相關性。受試者工作曲線(receiver operating characteristic, ROC)曲線分析血清TNF-α、M-CSF及miR-181a表達對AD的診斷價值。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1AD組和對照組一般資料比較 AD組和對照組之間在性別、年齡、文化程度、人際活動、高血壓史、冠心病史、糖尿病史、腦卒中史、吸煙史、飲酒史、TC、TG、HDL-C和LDL-C之間比較差異無統計學意義(均P<0.05)。見表1。

表1 AD組和對照組一般資料比較

2.2各組血清TNF-α、M-CSF及miR-181a水平比較 AD組血清TNF-α、M-CSF及miR-181a表達水平均明顯高于對照組(t=49.291、30.485、28.313,均P<0.05)。對照組、輕、中、重度組間血清TNF-α、M-CSF及miR-181a表達差異有統計學意義(F=846.924、600.930、449.211,均P<0.05)。見表2。

表2 各組血清TNF-α、M-CSF及miR-181a水平比較

2.3AD患者血清TNF-α、M-CSF及miR-181a表達的相關性 Pearson相關分析結果顯示,AD患者血清TNF-α與M-CSF、miR-181a表達呈顯著正相關(r=0.524、0.610,均P<0.05),M-CSF與miR-181a表達呈顯著正相關(r=0.498,P<0.05)。

2.4影響AD發生的多因素Logistic回歸分析 對影響AD的單因素進行多因素非條件 Logistic 回歸分析,將血清TNF-α、M-CSF及miR-181a引入回歸方程,結果提示血清TNF-α>27.18 ng/L、血清M-CSF>635.81 ng/L及血清miR-181a>1.83為影響AD發生的危險因素。見表3。

表3 影響AD發生的多因素Logistic回歸分析

2.5血清TNF-α、M-CSF及miR-181a對AD的診斷價值 血清TNF-α、M-CSF及miR-181a的曲線下面積分別為0.741(95%CI:0.684～0.789)、0.693(95%CI:0.630～0.757)、0.727(95%CI:0.682～0.774)及0.862(95%CI:0.818～0.899),聯合檢測診斷AD的曲線下面積大于TNF-α、M-CSF及miR-181a單獨診斷(Z=3.357、5.894、4.911,均P<0.05)。見表4,圖1。

表4 血清TNF-α、M-CSF及miR-181a及聯合檢測對AD的診斷效能

圖1 ROC曲線分析血清TNF-α、M-CSF及miR-181a及聯合檢測對AD的診斷效能

3 討 論

AD是一種漸進性的中樞神經系統變性疾病,表現為認知功能障礙、日常生活能力下降和行為改變,是造成老年癡呆的最主要原因[9]。AD的確切病因及機制尚不清楚,藥物治療只能延緩認知障礙的進程。因此,AD的早期診斷十分重要。目前對AD 的診斷主要依賴于臨床癥狀、體格檢查以及心理精神量表等,但對早期或非典型病例的診斷往往會存在偏倚[10]。近年來,通過影像學檢查以及腦脊液檢測也獲得一些有價值的生物標志物,但由于價格昂貴、有創以及部分有輻射等原因,而限制其在臨床的應用[11]。因此,探尋一種簡便易得且能準確反映AD病理進程的外周血清標志物成為目前研究的熱點。

淀粉樣前體蛋白等基因的突變導致β前體樣蛋白主要經β、γ分泌酶裂解為Aβ,Aβ大量聚集形成神經毒性的原纖維,促進AD的病情發展。Aβ沉積會誘發炎癥反應,同時伴有如TNF-α、白細胞介素1及M-CSF等細胞因子的釋放,加重炎性反應,促進AD患者神經元細胞凋亡[12]。炎性因子TNF-α、M-CSF在AD發生過程中發揮神經元毒性作用[13]。本研究中,AD 組血清TNF-α、M-CSF水平均高于對照組,并且TNF-α、M-CSF的表達與AD患者病情程度有關,是影響AD發生的危險因素,提示血清TNF-α、M-CSF表達升高可能通過激活體內炎性反應,促進AD疾病的發生及發展。分析其原因,一方面是AD發生時淀粉樣蛋白的神經纖維纏結激活小膠質細胞并激活補體產生TNF-α、M-CSF等炎癥因子,促進炎癥反應的同時,通過其神經毒性促使神經元發生凋亡[14]。另一方面,淀粉樣蛋白Aβ的沉積與氧自由基的產生密切相關,Aβ可誘發氧化應激,誘導超氧陰離子、羥自由基等活性氧物質的產生,促進活性氧自由基產生,產生氧化損傷,進而激活小膠質細胞和星形膠質細胞釋放TNF-α、M-CSF等細胞因子,而TNF-α、M-CSF等能夠損傷神經元,加重神經元炎癥損傷,導致AD患者疾病程度加重[15]。此外,M-CSF是一個重要的促進增殖的造血生長因子,其可通過刺激骨髓來源的CD34+造血干細胞分化和激活,促進微環境中單核細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞的擴增,分泌促炎性細胞因子,抑制腦組織中Aβ的清除,促進AD的疾病進展[5]。因此,血清TNF-α、M-CSF水平越高,反映AD患者神經元炎癥性損傷更為嚴重,可能是評估AD疾病嚴重程度的血清標志物。

miRNA是短的非編碼RNA,參與基因表達的轉錄后調控,與腫瘤、中風、糖尿病等疾病的發生發展關系密切。近年來發現,AD患者血清微小RNA存在異常表達的現象,可作為新的AD診斷的血清標志物[11]。miR-181a是嚙齒類動物海馬中豐富的微小RNA,可以調節多種與突觸可塑性相關蛋白,如cAMP反應元件結合蛋白1、沉默信息調節因子1等的表達,影響學習和記憶功能[16]。本研究中,AD組血清miR-181a明顯較高,與AD疾病嚴重程度有關,是影響AD發生的危險因素,提示miR-181a參與AD的疾病發生發展過程。既往研究表明,miR-181a在AD小鼠模型中的海馬組織中以病理依賴的方式顯著增加,并與可塑性相關蛋白水平降低相關[17]。miR-181a在調節活動依賴的突觸可塑性和記憶形成中發揮著關鍵作用,其表達升高可能導致功能突觸的加速喪失和認知功能衰退。筆者分析,血清miR-181水平升高能夠通過促進tau蛋白的過量表達和異常過度磷酸化,導致AD疾病嚴重程度加重。研究發現,在AD小鼠模型中miR-181a能夠促進了海馬中可溶性和突觸體富集的tau蛋白的形成,突觸中tau蛋白的積累能夠誘導NMDA受體N-甲基-D-天冬氨酸受體亞基2B亞基的磷酸化,引起神經元的興奮性毒性損傷,導致AD疾病的發生發展[18]。尚有研究表明,miR-181a可以負向控制蛋白激酶AMP激活的催化亞基α1的表達,降低腺苷酸活化蛋白激酶的活性,抑制哺乳動物雷帕霉素信號通路,促進神經退行性小鼠模型大腦中tau蛋白的總量和磷酸化水平,導致AD的進展[19]。因此,miR-181a在控制突觸可塑性中的潛在機制使其成為潛在的AD的標記物和治療靶點。

相關性分析發現,AD患者血清miR-181a與TNF-α、M-CSF表達呈顯著正相關,筆者分析其原因,可能是miR-181a的表達升高促進tau的異常磷酸化激活,造成神經元興奮性毒性損害,激活局部微環境中免疫細胞,造成繼發性的炎癥反應,促進TNF-α、M-CSF的分泌[20]。此外,TNF-α作為重要的細胞因子,亦能調控細胞內miR-181a的表達。研究表明,TNF-α能夠通過激活細胞表面的胰島素受體,促進細胞內miR-181a及miR-23a-3p的表達,參與胰島素抵抗的形成[21]。但AD中三者的具體作用機制仍有待深入研究。通過對血清中TNF-α、M-CSF、miR-181a及聯合檢測的敏感度、特異度和曲線下面積進行分析,血清TNF-α、M-CSF、miR-181a聯合檢測的敏感度、特異度及曲線下面積較高,提示,聯合三者檢測可以作為早期診斷AD的重要指標,不僅為AD的早期診斷提供了更有意義的生物標志物,也為其早期診斷依據提供了新的思路。

綜上所述,AD患者血清TNF-α、M-CSF及miR-181a表達升高,與疾病嚴重程度有關,三者聯合檢測對AD具有較高的診斷價值。血清TNF-α>27.18 ng/L、血清M-CSF>635.81 ng/L及血清miR-181a>1.83為影響AD發生的危險因素。但本研究樣本量較小, TNF-α、M-CSF及miR-181a在AD發病中的具體作用機制尚需擴大樣本量進一步研究。