甲基化酶DNMT3B、叉頭框蛋白C1與宮頸癌超聲特征的相關性分析

陳 然,肖 彬,管 鑫,喬金瑩

(湖北省十堰市人民醫院,湖北醫藥學院附屬人民醫院超聲科,湖北 十堰 442000)

宮頸癌是低收入和中低收入國家婦女中最常見的癌癥之一[1]。2020年超過50%的宮頸癌發生在生活在低收入和中等收入國家,對婦女健康造成嚴重損害[2-3]。盡管細胞學篩查無疑使宮頸癌負擔大幅下降,但因其檢測成本較高,導致該技術在基層醫療機構中的應用受限,近幾年經陰道和直腸超聲成為臨床評估子宮頸癌局部擴散的可行方案,對后續的精準治療至關重要[4]。近年來,通過基因組和蛋白質組學手段開發的分子標志物為疾病診斷和治療帶來了新的維度,DNA 甲基化已成為臨床重點的表觀遺傳學研究方向, DNA甲基轉移酶(DNA methyl transferase,DNMTs)是DNA 甲基化修飾的關鍵酶,DNA 甲基化修飾可以抑制惡性腫瘤的發生和發展過程中抑癌基因、促凋亡分子表達,同時可以促進癌細胞增殖,DNA甲基轉移酶3B(DNA methyltransferase 3 beta,DNMT3B)可以催化DNA 從頭甲基化過程,進而調控DNA 轉錄過程[5-6]。另外叉頭框蛋白C1(forkhead box protein C1,FOXC1)是叉頭框轉錄因子家族的成員,基因位于6p25染色體上,具有獨特的DNA結合叉頭結構域,FOXC1異常表達與細胞有絲分裂過程有關,進而對癌細胞增殖過程產生影響,敲除FOXC 1基因能通抑制癌細胞的體外增殖、遷移和侵襲[7]。DNMT3B、FOXC1在多種惡性腫瘤疾病中異常表達,但對宮頸癌的診斷價值鮮有報道。因此本次研究通過分析DNMT3B、FOXC1與宮頸癌超聲特征的相關性,以期為臨床提供更多的證據。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2013年5月—2016年4月于我院經病理診斷為宮頸癌的患者117例(研究組)與同期健康體檢女性50例(對照組)為對象。納入標準:未接受任何特殊治療,包括子宮切除術、放療或化療;擁有完整病歷資料,排除標準:擁有其他惡性腫瘤史或放化療史;先天性子宮畸形患者;凝血病患者;嚴重心、肝、腎功能障礙患者。 比較兩組基線資料發現,2組受試者年齡、更年期比例差異無統計學意義(t/χ2值=1.787、0.627,P>0.05),具有可比性。

所有患者均已簽署知情同意書。本研究已通過醫院倫理委員會審核準許。

1.2彩色多普勒超聲 選擇配備DC5-8D超聲探頭的飛利浦彩色多普勒超聲系統進行超聲檢測。檢測前排空直腸和膀胱。檢查時首先通過陰道超聲檢查子宮及雙側附屬區域,確定宮頸病變區域的位置、數量、大小、形狀、邊界、回聲及與周圍組織的關系。其次,選擇了彩色多普勒血流成像模式,觀察宮頸區內部及周圍的血流情況,計算并采集相關參數如血流、腫瘤大小等。

1.3Adler分級 根據檢測到的血流進行Adler分級[8],0級:宮頸形態正常,無明顯血流信號。Ⅰ級:1或2條直徑為<1 mm的小血管,宮頸形態稍增厚。Ⅱ級:不均勻或增厚的宮頸回聲分布,可檢測到3～4條小血管。Ⅲ級:子宮旁和子宮外浸潤和血轉移,并檢測到4條以上的血管,或者是交織成網絡的血管。

1.4腫瘤標志物檢測 抽取患者清晨空腹靜脈血液5 mL,離心后取血清,由我院檢驗科采用電化學發光法檢測血清糖類抗原125(carbohydrate antigen 125,CA125)、糖類抗原199(carbohydrate antigen 199,CA199)水平。

1.5蛋白質免疫印跡(Western blot,WB) 裂解液緩沖液(1×RIPA, cell Signaling Technology,USA)提血清中總蛋白,Bradford Assay(Bio-Rad,美國)測定蛋白濃度,將30 μg蛋白進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,然后轉移到聚偏二氟乙烯膜(Millipore,美國)。用含0.1% Tween 20的5%脫脂牛奶在室溫下封閉2 h后,用一抗在4 ℃下孵育過夜。DNMT3B與FOXC1的一抗(1∶1 000)來自Novus bioicals (Littleton,CO,美國,科羅拉多州)。在與辣根過氧化物酶結合的二抗(1∶5 000)孵育后,使用增強化學發光試劑(Thermo Pierce,USA)將蛋白顯影,使用Quantity Ones 4.4.1(Bio-Rad Laboratories,Berkeley,CA)密度法測定靶蛋白條帶水平。以β-actin為內參對照。

1.6統計學方法 應用SPSS 21.0統計軟件處理數據。計量資料采用單因素方差分析、SNK-q檢驗、t檢驗。計數資料采用χ2檢驗。Spearman相關系數、Pearson相關系數分析相關性。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1宮頸癌患者彩色多普勒超聲特征 我們采用Adler分級來描述宮頸癌患者的彩色多普勒超聲特征,隨著宮頸癌患者國際婦產科聯盟(International Federation of Gynecology and Obstetrics,FIGO)臨床分期的增加,宮頸癌患者的Adler分級也逐漸升高。50例對照組健康女性的Adler分級均為0級,宮頸癌FIGO臨床分期Ⅲ～Ⅳ級患者的Adler分級均為Ⅲ級。見表1。

表1 宮頸癌患者彩色多普勒超聲特征

2.2DNMT3B、FOXC1在宮頸癌中的表達 WB檢測結果顯示,研究組DNMT3B、FOXC1蛋白表達水平均高于對照組(P<0.05)。人工受試者曲線分析(ROC)結果顯示,DNMT3B、FOXC1診斷宮頸癌的AUC分別為0.889、0.925。見圖1,2,表2。

圖1 DNMT3B、FOXC1在宮頸癌中的表達

圖2 DNMT3B、FOXC1在宮頸癌中的蛋白表達圖

2.3DNMT3B、FOXC1與彩色多普勒超聲的相關性分析 隨著Adler分級的增加,宮頸癌患者DNMT3B、FOXC1的表達水平也越來越高(P<0.05),表明宮頸癌中DNMT3B、FOXC1的表達水平與Adler分級呈正相關。見圖3。

表2 DNMT3B、FOXC1鑒別診斷宮頸癌的ROC分析

圖3 DNMT3B、FOXC1與彩色多普勒超聲的相關性分析

2.4DNMT3B、FOXC1與CA125、CA199表達的相關性分析 CA125、CA199是兩個與宮頸癌密切相關的腫瘤標志物,因此分析了DNMT3B、FOXC1與CA125、CA199表達的相關性,Pearson相關性分析結果顯示,DNMT3B、FOXC1與CA125、CA199的表達均呈正相關。見圖4。

2.5DNMT3B、FOXC1與宮頸癌患者臨床特征的關系 將DNMT3B、FOXC1與117例宮頸癌患者的臨床特征進行分類比較,結果顯示,不同腫瘤大小、高危型HPV(-/+)、淋巴結是否發生轉移、FIGO分期不同的患者癌中DNMT3B的表達水平差異有統計學意義(P<0.05),另外FOXC1在不同分化程度以及FIGO分期的患者癌中表達差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

圖4 DNMT3B、FOXC1與CA125、CA199表達的相關性分析

表3 DNMT3B、FOXC1與宮頸癌患者臨床特征的關系

3 討 論

動態超聲是目前婦產科診斷和治療中應用最廣泛、最成熟的影像學方法之一[9]。在本次研究選擇了彩色多普勒超聲中反映宮頸癌血流豐富程度的Adler分級,分析DNMT3B、FOXC1與宮頸癌超聲特征的相關性,以期為不發達地區或基層醫院提供更多的診斷宮頸癌的手段。

DNMT3B可能是宮頸癌治療的新靶點。在Sun等[8]的研究結果中顯示,就病毒易感性而言,DNMT3B可以影響病毒與宿主間的相互作用,維持病毒持續存在,促進細胞發生病理改變。本次研究結果顯示,宮頸癌中DNMT3B、FOXC1的表達水平與Adler分級呈顯著正相關。這提示,檢測DNMT3B、FOXC1表達可以作為Adler分級的參考。由于腫瘤組織中血管的異常增生,宮頸癌細胞往往增殖、分裂迅速[10]。利用彩色多普勒超聲可以檢測腫瘤組織中各種類型的血流信號,反映腫瘤組織中的血管特殊結構和血流特征[11]。Adler分級主要集中在血流信號上,在一定程度上可以反映宮頸癌周圍血管的增殖和微血管密度。既往的研究[12]已報道血液信號在一定程度上可以預測腫瘤的侵襲和轉移能力。DNMT3B與FOXC1同樣被報道與肝癌的侵襲與轉移有關。Lai等[13]的研究結果顯示DNMT3B通過調節IL-6/STAT3的表達促進肝癌細胞的下垂和抑制細胞的增殖。但是DNMT3B與宮頸癌的研究還鮮有報道,因此本研究可能將未來宮頸癌的診治提供新得研究方向。而FOXC1則被miR-374c-5p調節參與宮頸癌的轉移,并且FOXC1在有淋巴結轉移的宮頸癌中表達上調[14]。我們也分析了DNMT3B與FOXC1宮頸癌患者臨床特征的關系,結果顯示DNMT3B與腫瘤大小、高危型HPV(-/+)、淋巴結是否發生轉移、FIGO分期有關,FOXC1與腫瘤分化程度以及FIGO分期有關。但目前關于這方面的相關報道較少,這個結論還需要更多的數據驗證。但總的來說,DNMT3B與FOXC1有望成為預測宮頸癌患者預后的可靠指標。

隨著腫瘤標志物研究的不斷深入,腫瘤相關標志物在癌癥診斷和治療中的作用日益重要[15]。有研究表明,宮頸癌與CA125和CA199標記物存在密切關系,也是宮頸癌的有效診斷標志物[16]。在本次研究中,CA125和CA199在宮頸癌中的表達均明顯升高,并且與DNMT3B、FOXC1的表達存在明顯正相關。本研究進一步分析了DNMT3B與FOXC1在宮頸癌中的診斷價值,ROC結果顯示DNMT3B與FOXC1對宮頸癌均具有較好的診斷價值。

不過需要注意的是,本次研究的樣本量不夠大,臨床分期相對粗糙,只進行了FIGO分期。其次本研究沒有借鑒宮頸癌特異性標志物如鱗狀細胞癌的腫瘤標志物,應在今后的研究中進一步闡明。而且Adler分級存在一定的主管因素,需要經驗豐富的醫師進行評價分級。

綜上所述,宮頸癌中DNMT3B、FOXC1表達與宮頸癌動態超聲結果有關,對宮頸癌的診斷有一定價值。