羧甲基-β-環(huán)糊精共價(jià)偶聯(lián)10-羥基喜樹堿的合成與性能

張 藝，張 瑞，周 婧，王 璐，申春曉

（信陽學(xué)院 理工學(xué)院，河南信陽 464000）

目前癌癥仍然是世界上最具破壞性的疾病之一。近年來隨著對(duì)腫瘤生物學(xué)的進(jìn)一步研究，以及診斷設(shè)備和治療方法的進(jìn)一步完善，癌癥的死亡率明顯下降[1-2]。然而，臨床上常用的化療治療因抗癌藥物的低溶解性及癌細(xì)胞的抗多藥耐藥性都使化療治療效率低，并且常伴有嚴(yán)重的毒副作用[3]。因此迫切需要解決藥物的溶解性和生物相容性問題，提高抗癌藥物的利用率。

β-環(huán)糊精（β-CD）是由7個(gè)α-葡萄糖重復(fù)單元，通過α-1, 4-糖苷鍵偶聯(lián)而形成的，具有親水性的表面和疏水性的空腔，具有低毒性和良好的生物相容性[4]，但是天然環(huán)糊精低的溶解度和單一的功能基團(tuán)，限制了它在功能超分子中的應(yīng)用，通過化學(xué)改性的方法將一些羥基改變成其他各種特定功能基團(tuán)后，其性能常發(fā)生較大改變[5]。近年來，在環(huán)糊精的改性方面有了大量的研究成果。如利用環(huán)糊精分子洞外表面的醇羥基發(fā)生酰化、酯化、交聯(lián)、醚化等化學(xué)反應(yīng)[6]，增加其他的功能基團(tuán)以改性合成具有相應(yīng)性能的環(huán)糊精衍生物，滿足了不同領(lǐng)域研究人員的需求。從而改變了環(huán)糊精的應(yīng)用范圍，如醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、化工生產(chǎn)、食品、信息技術(shù)、環(huán)保等領(lǐng)域[7]。在眾多的β-環(huán)糊精衍生物中，羧甲基-β-環(huán)糊精（CM-β-CD）為陰離子型β-CD 衍生物，有較好的溶解性能，對(duì)脂質(zhì)的溶解性較小，比HP-β-CD 溶血作用小。

羥基喜樹堿（HCPT）是一類具有細(xì)胞毒性的生物堿。但是由于HCPT 在水中的溶解度較差，結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，半衰期短并且能夠損傷正常組織細(xì)胞，限制了HCPT 在化療治療中的應(yīng)用。所以選用CM-β-CD 通過酯化反應(yīng)共價(jià)偶聯(lián)HCPT，可改善HCPT 的疏水性和生物相容性，在腫瘤組織中酯化酶的作用下可以有效控制藥物釋放，同時(shí)該合成工藝比較簡單。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

β-CD（分析純），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；氯乙酸（分析純），天津博迪化工股份有限公司；4-二甲氨基吡啶（分析純），1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亞胺鹽酸鹽（分析純），上海阿拉丁生化科技股份有限公司，傅里葉紅外光譜儀（INVENIOS 型）；雙光束紫外可見分光光度計(jì)（TU-19型）；真空離心凍干機(jī)（Pilot10-15M 型）。

1.2 羧甲基-β-環(huán)糊精的合成

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道方法制備羧甲基-β-環(huán)糊精如圖1所示。取9.08 g 的β-環(huán)糊精溶解在25%的氫氧化鈉溶液中，控制水浴溫度 在40~60℃，得到澄清透明的溶液。向其中滴加配制好的1 mol/L的氯乙酸水溶液（含氯乙酸6.426 g），水浴升溫至60℃，持續(xù)反應(yīng)4 h，反應(yīng)結(jié)束后先測(cè)定溶液的pH，加入適量的稀鹽酸調(diào)節(jié)pH為7左右，加入甲醇使其沉淀，直到不再生成沉淀為止，靜置，離心，干燥，得白色粉末5.3 g，產(chǎn)率為40.7%。

圖1 羧甲基-β-環(huán)糊精的合成

1.3 羧甲基-β-環(huán)糊精共價(jià)偶聯(lián)10-羥基喜樹堿的合成

取羧甲基-β-環(huán)糊精（0.162 mmol，250 mg）和10-羥 基 喜 堿（0.321 mol，117 mg）溶 解 在2 mL 的DMSO 中，在室溫下避光攪拌，隨后向其中加入EDC×HCl（18.8 mg，0.098 mmol），DMAP（12 mg，0.098 mmol），和 10 μL 的三乙胺，繼續(xù)攪拌24 h 后停止反應(yīng)，將反應(yīng)液裝入1 KD 的透析袋中，透析，離心。收集透析袋里的水溶液，凍干，最后收集淡黃色產(chǎn)物，質(zhì)量為15.5 mg，產(chǎn)率為13.6%。

1.4 HCPT/CM-β-CD的體外模擬釋藥實(shí)驗(yàn)

將HCPT/CM-β-CD（50 μg HCPT/2 mL）裝入到1 KD 透析袋中，分別放入10 mL pH 為5.0、6.5、7.4的PBS 緩沖溶液中，放置在37℃恒溫水浴振蕩器中釋放72 h。在釋藥過程中，分別在 0.25 h、0.5 h、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h、72 h 時(shí) 取 樣5 mL，隨后加入同等體積的對(duì)應(yīng)pH 的緩沖溶液。釋藥結(jié)束后利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)樣品中HCPT 的含量，并根據(jù)建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定HCPT 在不同 pH 的 PBS 中的釋放量。

式中：C為所取樣品的濃度（μg/mL）；W0為最初載藥量（μg）；n為取樣次數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 羧甲基-β-環(huán)糊精的結(jié)構(gòu)表征

由圖2可知，β-CD 單體在3 420 cm-1處的吸收峰為β-CD 的醇羥基吸收峰，而CM-β-CD 在1 610 cm-1和1 400 cm-1處出現(xiàn)了額外的-COO-的吸收峰，證實(shí)了羧甲基-β-環(huán)糊精的合成。

圖2 β-CD和CM-β-CD的紅外光譜

2.2 HCPT/CM-β-CD的結(jié)構(gòu)表征

CM-β-CD 和HCPT/CM-β-CD 的 紅 外 光 譜 圖 如圖3 所示。CM-β-CD 在3 450 cm-1處出現(xiàn)明顯的-OH的伸縮振動(dòng)，在 1 050 cm-1處出現(xiàn)強(qiáng)烈的C-O 鍵的伸展，在1 600 cm-1處出現(xiàn)碳氧雙鍵的吸收峰。但是在3 450 cm-1、1 050 cm-1兩 處，HCPT/CM-β-CD 的 吸 收峰明顯減弱。HCPT/CM-β-CD 在1 600 cm-1處沒有出現(xiàn)任何吸收峰。

圖3 CM-β-CD與HCPT/CM-β-CD的紅外光譜

為了測(cè)定HCPT/CM-β-CD 的載藥量，選用紫外分光光度計(jì)對(duì)10-羥基喜樹堿的含量進(jìn)行分析和測(cè)定。首先建立 10-羥基喜樹堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線，取10-羥基喜樹堿溶解在DMSO 中，配制成100 μg/mL 的HCPT溶液作為母液。然后加蒸餾水分別稀釋成0.5，2.5，5，10，15，20 μg/mL 的一系列標(biāo)準(zhǔn)液，用紫外-可見分光光度計(jì)分別測(cè)試這一系列標(biāo)準(zhǔn)液在 379 nm 處的吸光度，建立10-羥基喜樹堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖4所示。此標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=0000533c–0.00395（R2=0.9994）

圖4 10-羥基喜樹堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線

通過檢測(cè)透析液中10-羥基喜樹堿的含量計(jì)算該載藥聚輪烷的載藥量為20.7%。

2.3 HCPT/CM-β-CD的體外模擬釋藥分析

HCPT 和CM-β-CD 的共價(jià)偶聯(lián)是通過環(huán)糊精上的羥基和d-HCPT 的羧基酯化反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)。而酯鍵在酯化酶的存在下不穩(wěn)定容易發(fā)生酶解，因此可以通過斷裂酯鍵來實(shí)現(xiàn)藥物的釋放，如圖5所示。

圖5 37℃時(shí)HCPT/CM-β-CD的體外釋藥曲線

由圖5 可知，當(dāng)pH=5.0 時(shí)，HCPT 釋放速率相對(duì)較快，pH=6.5 時(shí)HCPT 的藥物釋放速率適中，在pH=7.4時(shí)累積釋放量較小。當(dāng) pH=5.0時(shí)釋放量達(dá)到79%，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)[8]，在催化酶的作用下酯鍵更容易斷裂。由于腫瘤環(huán)境的 pH 在5.0左右且有酶的存在，因此在腫瘤組織中藥物可以更有效地釋放。

3 結(jié)論與展望

利用氯乙酸對(duì)β-CD 進(jìn)行改性合成水溶性較好的CM-β-CD。通過酯化反應(yīng)共價(jià)偶聯(lián)10-羥基喜樹堿，并對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征和生物性能研究。紅外光譜顯示HCPT/CM-β-CD 成功合成，載藥量為20.7%。結(jié)合體外模擬釋藥實(shí)驗(yàn)對(duì)其生物性能進(jìn)行了探究，研究表明HCPT/CM-β-CD 可以有效提高HCPT 的穩(wěn)定性，并且可以有效控制藥物在腫瘤組織中的釋放，釋放量達(dá)到79%。采用CM-β-CD 共價(jià)偶聯(lián)10-羥基喜樹堿可以提高藥物的溶解性和穩(wěn)定性，并且能夠在腫瘤組織中得到有效釋放，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有較好的應(yīng)用前景。

本文只是通過體外模擬釋藥對(duì)HCPT/CM-β-CD進(jìn)行了生物性能研究，而且只研究了一種抗癌藥物，以后會(huì)選用擇更多地抗癌藥物對(duì)其進(jìn)行共價(jià)偶聯(lián)，提高抗癌藥物的溶解性和穩(wěn)定性，并進(jìn)一步通過體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)HCPT/CM-β-CD 進(jìn)行生物性能的研究。