肺鱗癌三級淋巴結構特征及其對預后的影響

翟今朝，卯云燁，李金鳳，董周寰，王玲兄，鄭 軒，葛祥偉，盧 迪，盛 舒，才巨星，秦嘉沛，王 安，胡 毅，汪進良

1 解放軍醫學院，北京 100853；2 解放軍總醫院第五醫學中心腫瘤醫學部腫瘤內科，北京 100071；3 解放軍總醫院第五醫學中心腫瘤醫學部研究所，北京 100853；4 解放軍總醫院第一醫學中心病理科，北京 100853

肺癌是世界上最致命和最常見的癌癥類型之一[1]。早期的肺癌患者以手術治療為主，但相當一部分患者會出現腫瘤的復發和轉移，從而影響患者生存。圍術期傳統的鉑類化療相比單純手術治療對ⅠB～ⅢA 期非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)患者的總生存期(overall survival，OS)提高僅約5%[2]。免疫檢查點抑制劑(immune checkpoint inhibitors，ICIs)出現之后，基于對晚期肺癌患者的顯著療效，早期可手術患者也可給予術前新輔助免疫治療[3-5]。三級淋巴結構(tertiary lymphoid structure，TLS)是在慢性炎癥(包括腫瘤)部位的非淋巴組織中發育的異位淋巴器官[6-7]。在腫瘤微環境(tumor microenvironment，TME)中TLS具有招募、活化和增殖T 淋巴細胞、B 淋巴細胞的功能，是腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor infiltrating lymphocyte，TIL)的重要來源，可有效支持抗原呈遞和淋巴細胞活化[7-8]。TLS 的存在與多種癌癥的復發風險降低、生存期延長以及提高對ICIs 的反應有關[6,9-10]。有回顧性研究分析結直腸癌、乳腺癌、肉瘤和 NSCLC 的ICIs 治療前腫瘤樣本，具有成熟TLS 患者腫瘤客觀緩解率和OS 得到提高[11]。但目前通過組織學評估的TLS 并未顯示ICIs 應答者的TLS 密度增加(與無應答者相比)[12]。本研究通過組織學分析手術切除的肺鱗癌(lung squamous cell carcinoma，LUSC)組織樣本，研究其TLS 特征，并分析其與LUSC 患者生存預后及新輔助免疫治療的關系，為TLS 預測患者生存預后及新輔助免疫治療療效提供參考。

資料與方法

1 臨床資料 該研究是一項回顧性隊列研究，納入2015-2022年解放軍總醫院18 例經新輔助免疫治療后經根治性切除的LUSC 患者臨床資料，同時納入2010-2018年解放軍第一四八醫院24 例未經新輔助治療經根治性切除的LUSC 患者臨床資料。本研究通過解放軍總醫院倫理審查委員會審核同意(倫審第S2019-228-02 號)。納入標準：(1)行LUSC 根治性切除術且病理診斷為原發性LUSC；(2)術前未行化療、放療；(3)經新輔助免疫治療患者術前接受標準化療聯合抗PD-1/PD-L1 抑制劑2 周期以上。排除標準：(1)小細胞肺癌、肺腺癌和其他癌癥；(2)醫療記錄和隨訪信息不完整。

3 TLS 定義及特征分析 TLS 定義為非淋巴組織部位的異位淋巴結構，最小可接受直徑200 μm，最小可接受所含淋巴細胞100 個，最小可接受淋巴細胞密度0.005/μm2[淋巴聚集體中所含淋巴細胞數/淋巴聚集體面積(μm2)]。記錄TLS 中淋巴細胞密度、TLS 最大面積和TLS 密度(切片組織TLS數量與組織面積比值)等TLS 相關特征，并根據形狀將其分為圓形/橢圓形和非規則形狀兩類。

4 分析指標 (1) TLS 特征：根據軟件細胞分類分析TLS 細胞密度、平均TLS 密度、TLS 面積、高/低細胞密度TLS 密度(0.0097/μm2)、圓形/橢圓形TLS 密度、非規則型TLS 密度等。以中位數劃分高、低組比較臨床指標的差異。(2)新輔助治療療效與TLS 特征的關系：以腫瘤最佳緩解深度[腫瘤退縮程度(%)]評價療效。(3) OS 與TLS 特征的關系。患者隨訪時間自手術日開始至患者死亡或最后一次隨訪結束(2022年12月)。

5 統計學分析 采用SPSSAU 23.0 在線應用軟件[14-15]和R (4.2.1)版本中R 包stats (4.2.1)、car、ggalluvial (0.12.3)進行統計分析，采用χ2檢驗分析TLS 特征與臨床指標的關系，采用Wilcoxon 秩和檢驗分析組間差異性，生存分析采用Kaplan-Meier 分析，結果用ggplot2 (3.3.6)包對數據進行可視化，P＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1 患者一般資料 本研究納入42 例接受LUSC根治性切除術的患者。中位年齡65(范圍：50～81)歲，男性40 例(95.24%)，女性2 例(4.76%)。中位隨訪時間23.5(4～83)個月，其中新輔助免疫治療患者18 例。見表1。

表1 患者的臨床特征(例，%)Tab.1 Baseline characteristics of the patients (n,%)

2 癌組織細胞分析 通過QuPath 軟件分析檢測細胞、人工注釋及訓練分類將檢測細胞分為腫瘤細胞、免疫細胞、其他細胞(包含纖維細胞、壞死區細胞、紅細胞及其他基質區細胞)和可忽略細胞(組織異常污染區、軟骨細胞和未被納入檢測的細胞)。病理組織細胞分類以柱狀圖呈現，經新輔助免疫治療患者相比未經新輔助治療患者的TLS 所含免疫細胞明顯增多。見圖1。

圖1 細胞分類柱狀圖1～18 為經新輔助免疫治療患者，a～z 為未經新輔助治療患者Fig.1 Cell classification histogram Serial numbers 1 to 18 represented cells from patients treated with neoadjuvant immunotherapy,a to z represented cells from patients without neoadjuvant treatment

3 TLS 特征與臨床指標的關系 以腫瘤組織檢測TLS 密度(0.088/mm2)、圓形/橢圓形TLS 密度(0.013/mm2)、高細胞密度TLS(0.013/mm2)、最大TLS 面積(0.20 mm2)的中位數，將對應的資料/患者進行兩分類/分組，分別列示于表2、表3、表4、表5。經比較知：較高的TLS 密度與新輔助免疫治療具有相關性(P＜0.001)，并與新輔助免疫治療緩解深度≥60%組具有相關性(P=0.007)(表2)；圓形/橢圓形TLS 密度在N 分期(P=0.025)、M 分期(P=0.038)方面有統計學差異，且密度＞0.013/mm2組與新輔助免疫治療具有顯著相關性(P=0.013)(表3)；3 周期以上的新輔助免疫治療與較低密度的高細胞密度TLS 有關(P=0.024)(表4)；年齡＜65 歲組最大TLS 面積大于年齡≥65 歲組(P=0.019)，并且最大TLS 面積在腫瘤分化程度中的差異有統計學意義(P=0.047)(表5)。

表2 TLS 密度與患者臨床指標的關系(例，%)Tab.2 Relationship between density of TLS and clinical indicators (n,%)

表4 高細胞密度TLS 與患者臨床指標的關系(例，%)Tab.4 Relationship between high-cell-density TLS and clinical indicators (n,%)

4 免疫治療療效與TLS 的關系 LUSC 患者經2 周期以上新輔助免疫治療患者1 例達完全緩解(complete response，CR)、13 例為部分緩解 (partial response，PR)、4 例為疾病穩定 (stable disease，SD)，7 例術后行輔助免疫治療，3 例出現疾病復發，無死亡事件發生。

腫瘤最佳緩解深度≥60%相比＜60%者，TIL密度(792.13/mm2vs410.56/mm2，P=0.032)、TLS 密度(0.20/mm2vs0.09/mm2，P=0.018)、TLS 中位面積(70010 μm2vs47040 μm2，P=0.014)顯著增高，低細胞密度TLS(0.106/mm2vs0.032/mm2，P=0.001)、非規則TLS(0.164/mm2vs0.064/mm2，P=0.014)同樣顯著增高；同時TLS 平均細胞數(1111vs629，P=0.083)、高細胞密度TLS(0.113/mm2vs0.020/mm2，P=0.206)、圓形/橢圓形TLS 相對增高(0.039/mm2vs0.013/mm2，P=0.083)。見圖2。

由電機通過齒輪帶動頂部的盤面回轉，一組模子放置在盤面的邊緣；為使模子可方便地翻轉從而取出限陽極板，采用如下方式：模子兩邊各帶一個軸頭，軸頭分別裝入帶座軸承，并隨之固定在盤面上，另外設置一個不連接的支點，這樣既可使模子保持水平，又可方便地翻轉模子。在設計過程中，還采用了其它各種措施，使得回轉盤結構緊湊，且運行平穩。

圖2 經新輔助免疫治療患者TLS 特征分析(小提琴圖)Fig.2 Characterization of TLS in patients treated with neoadjuvant immunotherapy (violin plot)

5 未經新輔助治療患者TLS 特征與生存分析 未經新輔助治療的患者中23 例達到死亡終點，失訪1 例，中位OS 為40 個月；OS≥3年患者相較于＜3年患者，TLS 密度(0.078/mm2vs0.052/mm2，P=0.042)、圓形/橢圓形TLS 密度(0.015/mm2vs0.005/mm2，P=0.046)更高。Kaplan-Meier 生存分析顯示TLS 密度較高組相較于較低組死亡風險降低36%[mOS：40 個月vs23.5 個月；HR(95%CI)：0.64(0.26～1.54) ；P=0.316]，圓形/橢圓形TLS 密度較高組相較于較低組具有相對更好的預后[mOS：53.5 個月vs25.0 個月；HR(95%CI)：0.44(0.18～1.06)；P=0.069]，最大TLS 面積高組相較于低組具有相對更佳的預后并降低死亡風險54%[mOS：50.0 個月vs25.0 個月，HR(95%CI)：0.46(0.19～1.08) ；P=0.074]。見圖3。

圖3 不同TLS 特征組生存分析A：OS≥3年與＜3年患者TLS 特征分析(小提琴圖) ；B、C 和D：TLS 密度(B)、最大TLS 面積(C)、圓形/橢圓形TLS 密度(D)的Kaplan-Meier 生存分析Fig.3 Survival analysis by TLS characteristics A:Analysis of TLS characteristics in patients with OS≥3 years vs OS＜3 years (violin plot);B,C and D:Kaplan-Meier analysis of the density of TLS (B),the area of maximum TLS (C),and the density of round/elliptical TLS (D)

討 論

TLS 是慢性炎癥和免疫刺激下發生在非淋巴組織(如TME)中的淋巴樣新生[9,16]，對TLS 的檢測主要通過對病理切片的免疫組織化學(immunohistochemistry，IHC)進行分析，這對于明確TLS 的存在很有價值。然而，IHC 的TLS 切片分析也存在一些局限性，如臨床樣本資源消耗過多、定量分析不便、TME 聯合分析復雜等[6,17]。既往研究是根據高內皮小靜脈、樹突狀細胞和其他標志物的表達來確定TLS 的密度，但根據我們的診斷經驗，這可能低估了TLS 的密度。因此我們的研究使用HE 染色的組織病理學載玻片和開源組織病理學圖像分析軟件QuPath 分析接受新輔助免疫治療LUSC 患者的TLS 特征變化。本研究首次針對TLS 特征分類，并對高/低細胞密度TLS、最大TLS 面積和TLS 密度等特征進行數據分析。

既往研究證明，TLS 中的某些細胞亞型在黑色素瘤和腎細胞癌免疫治療反應中起重要作用，其中免疫治療應答組中參與B 細胞功能和TLS 密度變化的基因表達顯著增加[18]。包括NSCLC、結腸癌、乳腺癌在內對免疫治療應答的患者具有更高的腫瘤TLS 特征，而具有高TLS 特征的患者具有更高的總生存率[11,19]。在本研究中同樣證明生存3年以上的患者TLS 密度、圓形/橢圓形TLS 密度、最大TLS 面積患者相對更高，降低了死亡風險。

有研究表明最大TLS 直徑與預后存在相關性，可以作為預后指標[20]，但在實際研究中發現，最大TLS 直徑可能受限于非規則型TLS 的形狀，無法特異性代表TLS 特征。本研究中發現新輔助免疫治療3 周期以上患者相較于新輔助治療2 周期患者高細胞密度TLS 密度相對降低；一項瑞士的研究表明，在未經治療的LUSC 患者中，TLS 密度是最強的獨立預后標志物。然而在新輔助化療后，并沒有發現TLS 密度的增加，反而造成生發中心(germinal center，GC)形成受損，導致TLS 密度的預后價值喪失[18]。另外一項來自中國的研究同樣表明，重復使用5-氟尿嘧啶會影響腫瘤免疫環境，而長期化療會損害抗腫瘤免疫力[21]。本研究首次將LUSC 新輔助免疫治療患者納入TLS 分析中，并且發現對免疫治療應答患者TLS數量和密度顯著增加、TLS 細胞密度增高、最大TLS 面積增高等特點，但因無法獲得治療前標本，故不能排除在治療前TLS 已形成。

本研究采用半自動化分析細胞，標記組織淋巴聚集區，在我們的研究中TLS 最小納入密度為0.005/μm2，所有TLS 平均淋巴細胞密度0.011/μm2，這遠高于非TLS 免疫細胞浸潤密度，與既往研究基本相符[22]。經新輔助免疫治療患者的腫瘤微環境有大量免疫細胞浸潤，其中參與形成TLS 的免疫細胞比例顯著增加，促進TLS 形成。與此同時，新輔助免疫治療與更高的TLS 密度、最大TLS 面積、TLS 平均細胞密度等特征有顯著相關性。

TLS 在實體瘤中的形成和功能尚未得到徹底解釋。既往研究中，TLS 被認為是成熟且緊密堆積的淋巴細胞，形成具有光滑圓形輪廓的離散實體，并且可以處于不同的成熟階段(即淋巴聚集體或具有GC 的聚集體)[7,12,23]。本研究將TLS 按照形狀分類，分為圓形/橢圓形和非規則形，圓形/橢圓形TLS 平均淋巴細胞密度為0.012/μm2，高于非規則TLS 細胞密度0.010/μm2，研究表明對新輔助免疫治療具有較高應答的患者圓形/橢圓形TLS 密度顯著增多，比例顯著提高。

在一項來自倫敦大學的研究中，以HE 染色載玻片為基礎，將TLS 區域淋巴細胞密度納入研究，提出應將TLS 最小面積、TLS 最小淋巴細胞數量、淋巴細胞密度作為TLS 定義標準[24]。本研究中發現新輔助免疫治療緩解深度≥60%患者相較于緩解深度＜60%患者具有更高的TLS 密度、TLS 中位面積、TLS 平均細胞數、低細胞密度和非規則TLS 密度，在研究過程中發現非規則TLS 具有直徑長、周長長、面積大、細胞密度相對低等組織學特點，這樣的特點在一定程度上增大了TLS 與腫瘤組織的接觸面積和接觸機會，同樣在腫瘤免疫微環境中發揮重要作用。

TLS 是抗腫瘤免疫反應的主要參與者，其在腫瘤進展過程中的相互關系和各自的動力學也有待破譯。TLS 的存在或其在癌癥治療后的誘導形成通常與有利的臨床結局相關并可預測治療效果。對TLS 及其在ICIs 治療中的積極作用的認識在不斷提高，對于TLS 形成和構成的深入研究將有助于進一步闡明TME 中的分子機制。目前，TLS 的B 細胞相關通路，即CXCL13/CXCR5 軸和CCL19/CCL21/CCR7 軸，被廣泛研究[22,25-26]。誘導TLS 的形成和通過TLS 抑制腫瘤發生有望成為未來研究方向。通過各種藥理學方法誘導TLS 形成并聯合ICIs、腫瘤疫苗、溶瘤病毒、局部瘤內抑制劑或干預療法等已成為增加冷腫瘤對ICIs 敏感性的新型手段。相反，在有強烈慢性炎癥、血管生成和纖維化基質的TME 紊亂熱腫瘤中，使用抗血管生成聯合ICIs 治療可能有助于使TME 質地正常化，有利于TLS 形成和提高對ICIs 的治療療效。TLS 和相應B 細胞通路可能成為T 細胞治療革命時代的新型抗腫瘤靶點代表[27-29]。

總體而言，盡管用于量化TLS 的方法存在異質性，但大多數研究發現TLS 密度與多種不同類型癌癥患者的生存期具有相關性。我們的研究也證實對于免疫治療應答較好的患者具有更高TLS 密度，但因本研究中18 例經新輔助免疫治療手術切除患者僅有3 人達到疾病復發，因此本研究缺少新輔助免疫治療生存分析結果證明TLS 密度對免疫治療生存預后的預測作用。

本研究具有一定的局限性：(1)因新輔助免疫治療方式的局限，研究的病例數量較少；(2)作為回顧性研究，對于進一步的研究，有必要通過積累大量多中心病例來闡明新輔助免疫治療促進TLS 成熟的機制，如對TLS 形態學的研究、GC樣結構的分析、TLS 位置與腫瘤邊緣關系、TLS形成與高內皮靜脈的關系等；(3)對于TLS 密度的定義和量化仍缺少科學證據，需進一步研究探索。

致謝特別感謝中國人民解放軍總醫院腎臟疾病實驗室對實驗給予的特別協助，感謝陳彤和張王靜怡給予的寶貴意見和無私幫助。

作者貢獻翟今朝：課題實施，研究結果驗證，軟件處理，可視化數據處理，文章撰寫；汪進良：課題主要設計、研究目的、研究結果審核，文章的評閱和修訂工作；胡毅：課題主要設計、研究結果審核，研究思路，文章的評閱和修訂工作；卯云燁：統計學分析，數據呈現，修改初稿；李金鳳：收集臨床數據信息，隨訪；董周寰：組織切片的染色和分析；王玲兄：切片數據分析及可視化；葛祥偉、秦嘉沛：細胞分類標識，構建細胞分類器，TLS 標記的審閱與修正；盧迪：圖像的特異性標記，統計分析；盛舒：初始數據的提取和整理；才巨星：初始數據的維護、篩選、隨訪；王安：臨床數據的分析與整理；鄭軒：數據分析和可視化的審核。

利益沖突所有作者聲明無利益沖突。

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