LC-MS/MS 法測定脆肉鯇魚肉中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考的殘留量

◆作者：羅敏意

◆單位：中山市小欖鎮農業服務中心

氯 霉 素（chloramphenicol）、甲砜霉素（thiamphenicol）、氟苯尼考（florfenicol）是一種酰胺醇類廣譜抗生素，對革蘭氏陽性菌和陰性菌均有較好的抑制作用，曾被廣泛用于畜禽和水產養殖業。然而，氯霉素可引起再生障礙性貧血、灰嬰綜合征等嚴重不良反應，我國農業農村部第250號公告明令禁止食品動物中檢出氯霉素及其鹽、酯。甲砜霉素和氟苯尼考在不同的動物源性食品中限量不同。

目前，國內已有畜禽產品和水產品等動物源性食品中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考殘留量測定的研究，而脆肉鯇魚肉中上述目標組分殘留量測定方法尚未見報道。中山市脆肉鯇養殖面積約3 萬畝，占全省脆肉鯇養殖面積約90%，為此，在中山市開展脆肉鯇魚肉中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考殘留量測定方法的研究具有重要意義，對日常風險監測及監管都有重要意義，也為脆肉鯇中其它抗生素類藥物殘留測定方法的建立提供參考（李盛安等，2022；董梅等，2022）。

1 儀器與試劑

液相色譜- 串聯質譜儀（QQQ6430，安捷倫科技有限公司）；電子天平（300JJ，常熟市雙杰測試儀器廠）；高速冷凍離心機（H1850R，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）；勻漿機（T18 basic，廣州儀科實驗室技術有限公司）；旋轉蒸發儀（R-210，瑞士步琪有限公司）；旋渦混合器（945601，美國Talboys 公司）；塑料離心管（50 mL，常德比克曼生物科技有限公司）；雞心瓶（100 mL，北京博美玻璃有限公司）；具塞三角瓶（250 mL，北京博美玻璃有限公司）。

甲醇、乙腈、乙酸乙酯、正己烷（色譜純，美國默克公司）；氯化鈉（AR，廣州化學試劑廠）；C18 固相萃取小柱（500 mg，6 mL，CNW 公司）；0.22μm 尼龍針式過濾器（上海安譜實驗科技股份有限公司）。

氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、氯霉素-D5標準溶液均為壇墨質檢科技股份有限公司。

2 實驗方法

2.1 樣品提取

稱取5 g 已均質的脆肉鯇魚肉（精確至0.01 g），置于50 mL塑料離心管中，加入100μg/mL氯霉素- D5內標工作液250μL，再加入5 mL 乙腈和5 mL 4%氯化鈉水溶液，渦旋振蕩2min，10℃9000 r/min 離心5 min，將上層液體轉移至另一塑料離心管，加入10 mL 正己烷，渦旋振蕩1 min，10℃9000 r/min 離心5 min，棄上層液體后加入5 mL 水飽和乙酸乙酯，渦旋振蕩1 min，10℃9000r/min 離心5 min，將上層液體轉移至雞心瓶，45 ℃200 bar旋蒸至干，加入4 mL5%乙腈水（V∶V=5∶95）復溶，備用。

2.2 樣品凈化

C18 固相萃取小柱分別用5 mL 甲醇和5 mL 水活化，樣液（2.1）過小柱，用3 mL 超純水洗滌小柱，擠干小柱后加入2.5 mL 50%甲醇水（V∶V=1∶1）洗脫，收集洗脫液并取適量過0.22 μm 濾膜后，供LC-MS/MS 測定。同時，做樣品空白試驗。

2.3 測定

2.3.1 液相色譜條件

色譜柱：安捷倫ZORBAX SB-C18，46 mm ×100 mm，18-Microm；柱溫：40 ℃；流動相：A 為甲醇，B 為超純水；流速：0.60 mL/min；進樣量：20μL。分離氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考的流動相梯度洗脫條件見表1。

表1 流動相洗脫梯度條件

2.3.2 質譜條件

離子源：電噴霧離子源；掃描方式：負離子掃描；檢測方式：多反應監測；電噴霧電壓：-400 V；干燥氣溫度：350 ℃，干燥氣流速11 L/min；霧化器壓力：40 psi；其他質譜參數見表2，特征離子質量色譜圖見圖1。

圖1 氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、氯霉素-D5 特征離子質量色譜圖

表2 氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氯霉素-D5 的質譜參數

3 結果與分析

3.1 前處理方法的選擇

朱志偉等（2007）研究表明，脆肉鯇魚肉中富含脂肪和蛋白質，其粗蛋白、脂肪和灰分含量均比普通草魚高，水分含量則低于普通草魚。為更好地去除魚肉中的脂肪和蛋白質，本文比較了多種提取凈化方法，最終選擇了乙腈水提取、正己烷除脂、乙酸乙酯反萃取的方法對脆肉鯇魚肉進行前處理，有效去除魚肉中的脂肪和蛋白質等成分，提高了目標組分的提取效率。此外，樣品提取、凈化效果良好，不僅延長了色譜柱的使用壽命，也減輕了儀器維護的壓力，節約了實驗成本。

3.2 線性回歸方程和檢出限

配制濃度分別為0.1，0.5，1，2，5，10μg/L 的系列空白基質混合標準溶液，加入適量內標工作液，上機測定。以標準溶液中目標組分和氯霉素-D5峰面積的比值為縱坐標，以濃度比為橫坐標，計算繪制標準工作曲線。

采用信噪比的方法來評估方法檢出限，當目標組分的特征離子峰與基線噪音值的比值＞3時為方法檢出限，信噪比＞10 為方法定量限（李龍，2022）。

目標組分的線性回歸方程、相關系數R2、方法檢出限及方法定量限見表3。結果表明，在0.1～10 μg/L 范圍內線性回歸方程呈良好的線性關系，相關系數R2均大于0.999，方法檢出限均為0.1μg/kg，方法定量限均為0.3μg/kg，能滿足日常大批量脆肉鯇魚肉中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考殘留量測定的需要。

表3 氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考的線性回歸方程、相關系數、方法檢出限及方法定量限

3.3 方法回收率和精密度

稱取5 g 不含氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考的脆肉鯇魚肉于50 mL 塑料離心管中，添加高、中、低3 個水平（25.0，12.5，7.5 ng）的標準溶液進行加標回收實驗，每個添加水平重復6 次。結果表明，目標組分的加標回收率在80.3%～103%，相對標準偏差（RSD）在0.766 %～3.27 %，該方法具有良好的回收率和精密度（詳見表4）。

表4 氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考的平均加標回收率及精密度

3.4 實際樣品的測定

采用本文建立的LC-MS/MS法測定中山市魚塘養殖的30 份脆肉鯇魚肉樣品，氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考均未檢出。

制備加標脆肉鯇魚肉樣品進行測定，樣品中各目標組分能被有效分離，基本無雜峰干擾，回收率較高，說明該方法運用到實際樣品測定中能得到較好的實驗效果。

4 結論與討論

本文建立了脆肉鯇魚肉中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考殘留量的LC-MS/MS 測定方法。該方法具有提取效高、定量準確及節約成本等優點。本文選擇合適的試劑、耗材對樣品前處理步驟進行優化，選用合適的色譜柱和質譜測定條件，有效分離目標組分，大大提高了測定準確率，能滿足日常大批量檢測的需要，也為其它抗生素類藥物殘留測定方法的建立提供參考。

參考文獻：（略）