新疆拜城縣馬鈴薯瘡痂病病原菌的分離鑒定及生物學特性分析

徐李娟,陳 勇,王則玉,王 博,艾尼江·爾斯滿,郭 瑞,李克梅,宋素琴,4

(1.新疆農業大學農學院,烏魯木齊 830052;2.新疆農業科學院微生物應用研究所/新疆特殊環境微生物重點實驗室,烏魯木齊 830091;3.新疆農業科學院土壤肥料與農業節水研究所,烏魯木齊 830091;4.新疆綠洲農業病蟲害治理與植保資源利用自治區高校重點實驗室/石河子大學農學院,新疆石河子 832003)

0 引 言

【研究意義】馬鈴薯瘡痂病是由多種鏈霉菌(Streptomycesspp.)引起的一種土傳病害,造成馬鈴薯品質下降[1]。致病菌中與致病性相關的基因分布在染色體中同一區域,致病島(pathogenicity island,PAI)中,該區域可以從致病鏈霉菌菌株水平轉移到其他不含致病基因的鏈霉菌屬中的其他種中,從而產生新的致病菌株,因此致病鏈霉菌具有多樣性,不同產區病原菌種類及組成有所不同;其中thaxtomin A(ThxA)毒素是其重要的致病因子,其合成基因位于PAI的第一部分,即“毒素區”[2-5]。感病馬鈴薯塊莖表面粗糙,形成瘡痂狀病斑,不僅影響馬鈴薯的外觀及品質,且馬鈴薯表皮組織遭到破壞,導致土壤中其它病原菌更容易侵染薯塊[6-8]。馬鈴薯播種面積不斷擴大,瘡痂病的發生也日益嚴重,在山西、內蒙古等地瘡痂病發病率達到30%～60%,嚴重地塊高達100%[9,10]。新疆生脫毒馬鈴薯微型薯發病率最高可達80%以上[11]。瘡痂病對馬鈴薯的生產造成嚴重損失,已成為制約馬鈴薯產業快速發展的因素之一。【前人研究進展】瘡痂病致病菌由Roland Thaxter分離得到,命名為S.scabies[12]。除了S.scabies,S.acidiscabies和S.turgidiscabies3種常見病原菌外[13],其他國外已經報道病原有27種,包括S.atroolivaceous、S.cinerochromogenes、S.corchorusii、S.diastatochromogenes、S.lydicus、S.malachiticus、S.albogriseolus[14, 15]、S.europaeiscabiei[16]、S.violaceus、S.gnseus、S.exfoliatus、S.rocbei[17]、S.reticuliscabiei、S.aureofaciens、S.albidoflavus[18-20]、S.caviscabies[21]、S.luridiscabiei、S.puniciscabiei、S.niveiscabiei[22]、S.stelliscabies[19]、S.brasiliscabiei[23]、S.alkaliscabies[24]、S.cinereus、S.collinus、S.longisporoflavus[25]、S.flavidofuscus、S.ipomeae[26]。我國馬鈴薯瘡痂病菌的分布也呈現地域氣候的差異,目前已報道的致病瘡痂鏈霉菌病原共有18種,包括S.caviscabies、S.anulatus、S.scabies、S.turgidiscabies、S.acidiscabies、S.europaeiscabiei、S.luridiscabiei、S.enissocaesilis、S.griseus、S.aureofaciens、S.bobili、S.galilaes、S.bottropensis、S.stelliscabiei、S.luridiscabiei、S.griseoaurantiacus、S.setonii、S.reticuliscabiei,分別在云南省[1]、內蒙古[10]、山東[13]、黑龍江[27]、甘肅[28]、貴州[29]等省(區)。【本研究切入點】新疆土質多為灰漠土,適宜馬鈴薯生長。2019年拜城縣馬鈴薯種植面積2 666.67 hm2(4萬余畝),單產4 t/667m2,總產量16×104t。但目前僅伊犁有報道病原菌為S.scabies、S.acidiscabies[30],缺乏對新疆不同地區馬鈴薯瘡痂病病原菌的組成系統性研究,有關拜城馬鈴薯產區未見報道。需進一步探明新疆不同地區馬鈴薯瘡痂病病原菌的種類。【擬解決的關鍵問題】采集新疆阿克蘇地區拜城縣瘡痂病病薯及薯表土壤進行病原菌的分離鑒定及生物學特性研究,為該地區馬鈴薯瘡痂病的防治提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試土樣及馬鈴薯塊莖采集自新疆阿克蘇地區拜城縣察爾齊鎮。培養基為高氏1號培養基(可溶性淀粉20 g,硫酸鎂0.5 g,氯化鈉 0.5 g,磷酸氫二鉀 0.5 g,硝酸鉀1.0 g,硫酸亞鐵 0.01 g,瓊脂15～20 g,水1 000 mL)、碳源利用基礎培養基(氯化錳7.9 mg,磷酸氫二鉀5.65 g,硫酸鋅 1.5 g,硫酸鎂1.0 g,硫酸銨1.5 g,硫酸銅6.4 mg,硫酸亞鐵1.1 mg,磷酸二氫鉀2.38 g,瓊脂15～20 g,水1 000 mL)、氮源利用基礎培養基(氯化鈉5 g,葡萄糖10 g,磷酸氫二鉀1.0 g,硫酸鎂5.0 g,瓊脂15～20 g,水1 000 mL)、燕麥瓊脂培養基(燕麥30 g,瓊脂瓊脂15～20 g,水1 000 mL)、Tresner 瓊脂培養基(檸檬酸鐵0.5 g,蛋白胨10 g,瓊脂15～20 g,水100 mL)、酪氨酸瓊脂培養基(酪氨酸1.0 g,NaCl 8.5 g,酵母浸提物 1.0 g,瓊脂 15～20 g,水1 000 mL)、淀粉水解培養基(氯化鈉0.5 g,硝酸鉀1.0 g,硫酸鎂0.5 g,磷酸氫二鉀0.5 g,可溶性淀粉10.0 g,水1 000 mL)。

對照菌株SteptomycesbottropensisAMCC40023,由山東農業大學提供。

1.2 方 法

1.2.1 病原菌的分離、純化

用流水沖洗病薯,自然晾干,切取病健交界處進行消毒,無菌水沖洗3次后,將切取病健交界處的組織置于無菌研缽中研磨呈成勻漿,加入9 mL的無菌水,震蕩10 min,取1 mL研磨的勻漿放入含有9 mL無菌水的試管中,梯度稀釋,取各梯度稀釋液100 μL均勻涂布于燕麥培養基及高氏I號培養基中,置于30℃培養5～7 d后,挑取不同形態的單菌落進行純化,接入高氏1號斜面,4℃冰箱保存。圖1

圖1 田間感病馬鈴薯塊莖的癥狀

1.2.2 馬鈴薯瘡痂病病原的致病性測定

馬鈴薯瘡痂病毒素產生的致病基因有txtAB、nec1 和tomA。通過PCR 擴增技術,以標準菌株SteptomycesbottropensisAMCC40023為對照,對txtAB、nec1、tomA基因檢測。產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。表1～3

表1 PCR反應體系

表2 菌株鑒定及相關引物序列

表3 馬鈴薯瘡痂病致病基因PCR擴增條件

1.2.3 致病性測定

1.2.3.1 蘿卜幼苗法

將菌株接種至高氏1號液體培養基中,30℃,150 r/min,培養7 d,用75%無水乙醇對蘿卜種子表面消毒,再用無菌水連續沖洗3次,晾干,將晾干的種子放置于含有濕潤無菌濾紙的培養皿中進行催芽,選取長勢一致的種子分裝到含有1%水瓊脂的試管中,每試管放入3粒種子,將培養好的菌液200 μL接種至試管中,以接種無菌液體培養基為空白對照,每個處理重復3次,將試管放置于光照培養箱間歇培養,7 d后觀察。

1.2.3.2 小薯片法

將菌株接種至高氏I號培養基中,30℃,培養7 d,選取健康的馬鈴薯(費烏瑞它)塊莖,75%表面消毒,無菌水沖洗,用無菌打孔器在塊莖上打孔,無菌手術刀切成厚度一致的薯片,放置于含有1%水瓊脂的培養皿中,每皿放入4片,用打孔器在平板中打孔,將菌餅倒置放置在小薯片中央,以未接菌的培養基為對照,30℃恒溫培養10 d,觀察小薯片是否褐變壞死。

1.2.4 病原菌鑒定

1.2.4.1 病原菌形態特征

用接種針挑取生長7 d的菌落,接種至高氏I號培養基中,用無菌鑷子夾取滅菌后的蓋玻片,45°斜插在培養基中,培養7 d,在電子顯微鏡下觀察病菌孢子鏈和孢子的形態特征。

1.2.4.2 病原菌生物學特性

根據國際鏈霉菌計劃(ISP),進行病原菌的生理生化鑒定。

1.2.4.3 病原菌分子生物學鑒定

采用鏈霉菌16S rDNA通用擴增引物,PCR反應體系為20 μL:10 μL Mix;2 μL模板,上下游引物各1 μL,dd H2O 6.4 μL。通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。通用引物為PA/PH。由鼎國昌盛有限公司進行測定。測序結果在NCBI上進行比對,利用Mega7.0構建系統進化樹。

1.3 數據處理

數據運用統計軟件(SPSS 17.0軟件)進行差異顯著性分析,用Excel軟件分析并作圖;利用生物軟件MEGA 7.0構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 病原菌的分離

研究表明,從新疆阿克蘇地區拜城縣察爾齊鎮采集的馬鈴薯塊莖樣品中共分離放線菌72株,其中鏈霉菌28株。

2.2 馬鈴薯瘡痂病病原的致病性測定

2.2.1 病原菌的致病基因 PCR檢測

研究表明,菌株K6在385、700、392 bp大小處有清晰的條帶,分別對應txtAB、nec1、tomA3種致病基因,并與標準菌株SteptomycesbottropensisAMCC40023條帶一致,菌株K6同時具有txtAB、nec1、tomA3種基因。圖2

M:DL 2000 DNA Marker;1:Steptomyces bottropensis AMCC40023;2:K6菌株

2.2.2 蘿卜幼苗法致病性測定

研究表明,K6菌株能夠抑制蘿卜幼苗的生長。圖3

注:A:空白對照;B:接種K6菌株

2.2.3 小薯片法致病性測定

研究表明,接種菌餅的馬鈴薯片和蘿卜片培養10 d 后,小薯片中央部位顏色變深,并產生壞死性病斑,而對照的小薯片和蘿卜片無明顯變化,說明K6菌株具有較強的致病性。圖4

注:A:馬鈴薯片空白對照;B:馬鈴薯片接種K6菌株;C:蘿卜片空白對照;D:蘿卜片接種K6菌株

2.3 病原菌鑒定

2.3.1 病原菌形態特征觀察

研究表明,菌株K6高氏1號培養基培養7 d后,菌落為圓形、孢子灰色,基絲紅褐色,無色素產生。圖5

注:A:菌落形態;B:孢子形態;C:菌絲形態

2.3.2 病原菌的生理生化特征

研究表明,菌株K6能夠以D-葡萄糖、D-甘露醇、棉子糖、α-乳糖、D-果糖、海藻糖、山梨醇、L-阿拉伯糖、肌醇等作為單一碳源。能夠以甲硫氨酸、硫酸銨、酵母粉、組氨酸等作為單一氮源,能夠產生H2S,可以使淀粉水解,對6%NaCl、苯酚(0.1%)、鏈霉素(20 μg/mL))敏感,在pH4的條件下不能正常生長。表4

表4 菌株K6生理生化特征

2.3.3 病原菌16S rDNA序列

研究表明,菌株K6 與S.bobili(NR 112584.1)親緣關系最近,序列相似度為99.64%,鑒定為S.bobili。圖6

圖6 基于16S rDNA構建的菌株K6系統發育樹

3 討 論

瘡痂鏈霉菌病原多樣性和種群分布受馬鈴薯品種、種植季節、海拔高度及土壤pH等多種因素影響,且寄主范圍較廣,除馬鈴薯外,還有蘿卜、甜菜和胡蘿卜等寄主[27,31]。國外已報道的瘡痂病菌有30多種,其中S.scabies,S.acidiscabies和S.turgidiscabies分布最為廣泛[32]。國內對馬鈴薯瘡痂病菌的研究起步較晚,目前國內已報道的瘡痂鏈霉菌病原有18種,杜娟在新疆伊犁地區分離到S.acidiscabies和S.scabies[30]。研究從新疆拜城縣分離得到1種致病菌S.bobiliK6,在我國河北、內蒙古、甘肅、山東等省(區)地均發現該病原菌[30]。但是試驗中并沒有分離得到S.acidiscabies和S.scabies,可能是由于地區原因所導致。

4 結 論

引起新疆拜城縣馬鈴薯瘡痂病的病原為S.bobili,致病性較強,菌株K6的碳源和氮源廣泛,能夠產生H2S,可使淀粉水解,對6%NaCl、0.1%苯酚和20 μg/mL鏈霉素敏感,在pH4的條件下不能正常生長。