新型轉基因高產棉花萌發期和苗期耐鹽性與耐堿性評價

宋冰梅,姜 巖,陳 鑫,3,張 宇,程宛楠,潘洪生

(1.新疆大學生命科學與技術學院/新疆生物資源和基因工程重點實驗室,烏魯木齊 830046;2.新疆農業科學院植物保護研究所/國家植物保護庫爾勒觀測實驗站,烏魯木齊 830091;3.新疆農業大學農學院/棉花教育部工程研究中心,烏魯木齊 830052;4.中國農業科學院植物保護研究所/植物病蟲害生物學國家重點實驗室,北京 100193)

0 引 言

【研究意義】2021年新疆棉花種植面積占全國的82.8%[1]。轉Bt(Bacillusthuringiensis)基因棉花商業化種植[2],相對于非轉基因棉花其具有抗蟲、增產、減少化學農藥使用量等優勢[2-3],且增加單位面積棉花產量[4]。棉纖維長度是影響棉花產量和品質的關鍵因素,Bn-csRRM2(RNA recognition motif 2 ofBrassicanapus)過表達能夠抑制棉花細胞周期進程,從而調節細胞大小使其纖維長度顯著高于親本對照[5]。2012年中國農業科學院棉花研究所將Bn-csRRM2轉入我國主栽棉花中棉所12號(CCRI-12)中獲得轉Bn-csRRM2基因高產棉花HN9311[6],其鈴重、總鈴數、籽棉產量、皮棉產量均顯著高于中棉所12號的[7]。【前人研究進展】鹽堿脅迫影響著全球約10×108hm2的干旱和半干旱地區,也是影響農作物產量的重要因素之一[8],每年造成農作物產量的損失達273×108美元[9]。新疆土地鹽堿化程度較重,鹽漬化土壤面積為2181.4×104hm2,占全國鹽漬土面積的22.01%,其中鹽堿化的耕地達122.88×104hm2[10]。棉花植株對鹽堿脅迫具有一定的抵抗能力,但土壤中鹽堿的積累仍然會減少其對水分和養分的吸收[11]。在鹽堿脅迫下棉花的根長、株高、種子萌發和果實發育等直接指標會顯著下降[12],其生長發育受到較大影響[13]。土壤鹽漬化能夠導致棉花產量降低50%～60%[14],其程度與棉田出苗率和產量顯著負相關[15]。如若0～100 cm土層(根區)脫鹽率為24.93%,棉花成活率便能從1.48%提高到42.04%,產量從72.43 kg/hm2增加到3 075.90 kg/hm2[15]。【本研究切入點】不同棉花品種的耐鹽堿性差異較大且耐鹽堿脅迫能力與生長發育階段密切相關[16-18]。萌發期和苗期是棉花生長的關鍵時期[19],兩個時期的棉花對鹽堿脅迫最為敏感[20]。Bn-csRRM2基因屬于外來基因,被轉入棉花后會打破其固有的生長發育與新陳代謝模式。因此,在鹽堿脅迫下HN9311與親本對照相比,其生長發育狀態及耐鹽堿性都有可能發生改變。目前,關于轉Bn-csRRM2高產棉花HN9311的研究主要集中在其對棉田微生物[21]、昆蟲等生物群落的影響[6,22],關于鹽堿脅迫對其萌發期和苗期的影響尚未見報道。【擬解決的關鍵問題】研究以轉Bn-csRRM2基因高產棉花HN9311和中棉所12號(親本對照)為研究對象,以直接指標和相對指標作為評價標準,研究鹽脅迫和堿脅迫對其萌發期和苗期生長發育的影響及其耐鹽與耐堿性,以期為新型轉基因高產棉花的商業化種植提供重要的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗所用NaCl和NaHCO3均購自天津博迪化工有限公司,Hoagland's營養液參照付媛媛等[23]配方自行配制;新型轉基因高產棉花HN9311和中棉所12號均由中國農業科學院棉花研究所提供。

1.2 方 法

1.2.1 萌發期耐鹽性和耐堿性評價

試驗在國家植物保護庫庫爾勒觀測實驗站(新疆巴州庫爾勒市和什力克鄉庫勒村,41°45′00″N,85°48′60″E)進行,試驗方法參照張國偉等[24]并改進。挑選100粒飽滿的棉花種子,用150 mmol/L的NaCl溶液或70 mmol/L的NaHCO3溶液浸泡12 h(分別以去離子水作為對照),待其吸足水分后放置于鋪有2層定性濾紙的發芽盒(19 cm × 13 cm × 5 cm)內,隨后加入20 mL浸泡時所用溶液,每處理組重復4次。發芽盒上覆蓋保鮮膜保濕,1～4 d將其分別放置于溫度(25±1)℃、相對濕度50%和無光照的人工氣候箱內催芽,第5 d后開始每天以400～600 μmol/(m2·s)光照14 h,每天10:00補充蒸餾水以保持濾紙濕潤,第3～7 d統計種子發芽數,并在第7 d每個重復選取4個芽苗測定其下胚軸長、根長和鮮質量。

1.2.2 苗期耐鹽性和耐堿性評價

試驗在溫度(25±1)℃、相對濕度50%、光照頻率14L∶10D和光強400～600 μmol/(m2·s)的人工氣候箱內進行。在底部具孔的營養缽(高12 cm、直徑10 cm)中放入一定重量蛭石(基質含水量35%)并播入3粒飽滿且無裂口的棉花種子(播種深度一致),出苗后每個營養缽留1株長勢一致的棉苗,將其置于30 cm×15 cm的托盤中。每盤放置12株,盤中注入1 L含有NaCl(150 mmol/L)或NaHCO3(70 mmol/L)的Hoagland's營養液,分別以不含有NaCl或NaHCO3的Hoagland's營養液作為對照(CK)。試驗期間每個托盤每天10:00補充去離子水,每隔5 d補充1次營養液,每個處理重復4次。于處理第21 d(大約5葉期)時每個重復選取4株測定其真葉數、株高、根長、根鮮重量和地上部鮮重量。

1.3 數據處理

測量直接指標,計算發芽勢、發芽率和活力指數以評價鹽脅迫和堿脅迫對HN9311萌發期和苗期生長發育的影響;計算相對指標、相對鹽/堿害率,評價HN9311萌發期和苗期耐鹽/堿脅迫能力。

鮮重量=地上部鮮重量+根鮮重量;

根冠比=根鮮重量/地上部鮮重量;

發芽勢=第3d發芽種子數/供試種子總數×100%;

發芽率=7d內發芽種子數/供試種子數×100%;

發芽指數=ΣGt/Dt(式中,Gt為時間t的發芽數,Dt為相應的發芽天數);

活力指數=S×發芽指數(式中,S為芽苗的鮮質量);

相對指標=實驗組測定值/對照組測定值;

相對鹽/堿害率=(對照組發芽率-實驗組發芽率)/對照組發芽率×100%。

采用Microsoft Excel 2021、SPSS 20和Origin 2022進行數據的統計、分析和圖表制作。鹽/堿脅迫下HN9311萌發期和苗期直接指標均符合正態分布(峰度和偏度系數法)和方差齊性(One-way ANOVA檢驗),采用Duncan新復極差法進行多重比較;鹽/堿脅迫下HN9311萌發期和苗期相對指標和相對鹽/堿害率均符合正態分布,采用參數獨立樣本T檢驗法檢驗,僅苗期鹽脅迫下相對株高不符合正態分布通過非參數Mann-Whitney檢驗。

2 結果與分析

2.1 鹽/堿脅迫對HN9311萌發期和苗期直接指標的影響

研究表明,對照組(0 mmol/L NaCl與0 mmol/LNaHCO3)之間HN9311直接指標均無顯著性差異(P>0.05)。鹽脅迫和堿脅迫下HN9311鮮重量(F=55.49,df=3,15,P<0.001)、下胚軸長(F=5.80,df=3,15,P=0.011)、根長(F=951.82,df=3,15,P<0.001)、發芽勢(F=1216.05,df=3,15,P<0.001)、發芽率(F=662.00,df=3,15,P<0.001)、發芽指數(F=3807.30,df=3,15,P<0.001)和活力指數(F=305.67,df=3,15,P<0.001)均顯著下降。鹽脅迫下HN9311發芽勢、發芽率、發芽指數、活力指數的下降程度均顯著高于堿脅迫,堿脅迫下根長的下降程度顯著高于鹽脅迫。表1

表1 鹽/堿脅迫下新型轉基因高產棉花HN9311萌發期直接指標變化

對照組(0 mmol/L NaCl與0 mmol/L NaHCO3)之間HN9311直接指標均無顯著性差異(P>0.05)。鹽脅迫和堿脅迫下HN9311根冠比顯著增強(F=110.40,df=3,15,P<0.001),株高(F=70.06,df=3,15,P<0.001)、根長(F=125.58,df=3,15,P<0.001)、根鮮重(F=126.04,df=3,15,P<0.001)、地上部鮮重(F=524.84,df=3,15,P<0.001)和鮮重量(F=456.49,df=3,15,P<0.001)均顯著下降,真葉數(F=12.02,df=3,15,P=0.001)僅在堿脅迫下顯著下降。除根冠比以外,堿脅迫下所有直接指標下降程度均顯著高于鹽脅迫。鹽/堿脅迫對HN9311萌發期和苗期的生長具有顯著的抑制作用,苗期對堿脅迫比鹽脅迫更為敏感。表2

表2 鹽/堿脅迫下新型轉基因高產棉花HN9311苗期直接指標變化

2.2 鹽/堿脅迫對HN9311萌發期和苗期相對指標的影響

研究表明,鹽脅迫下HN9311萌發期相對鮮重量(T=3.45,df=6,P=0.014)、相對發芽勢(T=12.88,df=6,P<0.001)、相對發芽率(T=4.12,df=6,P=0.006)、相對發芽指數(T=11.00,df=6,P<0.001)和相對活力指數(T=8.05,df=6,P=0.001)均顯著低于中棉所12號;堿脅迫下HN9311相對下胚軸長(T=5.63,df=6,P=0.004)、相對發芽指數(T=3.46,df=6,P=0.013)均顯著高于中棉所12號,相對鮮重量(T=9.82,df=6,P<0.001)顯著低于中棉所12號。鹽脅迫下HN9311苗期相對根鮮重(T=7.73,df=6,P<0.001)、相對地上部鮮重(T=3.55,df=6,P=0.012)和相對鮮重量(T=5.14,df=6,P=0.002)顯著低于中棉所12號;堿脅迫下HN9311相對根冠比(T=12.80,df=6,P<0.001)顯著高于中棉所12號,相對株高(T=3.60,df=6,P=0.023)、相對根鮮重(T=13.82,df=6,P=0.004)、相對地上部鮮重(T=16.75,df=6,P<0.001)和相對鮮重量(T=16.47,df=6,P<0.001)均顯著低于中棉所12號。HN9311萌發期耐鹽脅迫能力和苗期耐鹽/堿脅迫能力均低于中棉所12號。表3,表4

表3 鹽/堿脅迫下新型轉基因高產棉花HN9311萌發期相對指標變化

表4 鹽/堿脅迫下新型轉基因高產棉花HN9311苗期相對指標變化

2.3 鹽/堿脅迫對HN9311相對鹽/堿害率影響

研究表明,HN9311相對鹽/堿害率分別為27.0%、21.0%,中棉所12號分別為22.75%、23.00%,其中HN9311相對鹽害率顯著高于中棉所12號的(T=3.47,df=6,P=0.013),其相對堿害率與中棉所12號的無顯著性差異(P>0.05),HN9311萌發期耐鹽脅迫能力低于中棉所12號的。圖1

注:*、ns分別代表HN9311與中棉所12號相對鹽害率具有(P<0.05)或不具有(P>0.05)顯著性差異(獨立樣本T檢驗法檢驗)

3 討 論

3.1通過直接和間接鑒定法[19]研究了鹽/堿脅迫對HN9311萌發期和苗期生長發育的影響并對其耐鹽/堿脅迫能力進行了評價。研究表明,與中棉所12號相比,除真葉數和根冠比以外,HN9311萌發期和苗期各項直接指標均顯著下降,苗期對堿脅迫比鹽脅迫更為敏感,并且HN9311萌發期耐鹽脅迫能力和苗期耐鹽/堿脅迫能力均低于中棉所12號的。

3.2植物的鹽堿應激反應是一個極為復雜的過程,涉及到轉錄和代謝等方面[25-26]。因此通常利用植物生長過程中的生理指標來評價鹽堿脅迫下植物生長發育的復雜情況以及其耐鹽堿脅迫能力[3,27-28],其中鮮重量、發芽勢、發芽率、根長、下胚軸長、發芽指數和活力指數是評價萌發期棉花生長狀態的重要直接指標,其數值大小與萌發期棉花生長發育情況以及耐鹽堿脅迫能力正相關[29-31]。研究發現,在鹽/堿脅迫下HN9311萌發期所有直接指標均顯著下降,其種子質量被顯著抑制且萌發期的生長發育受到較大影響。

3.3真葉數、株高、根長、根鮮重、地上部鮮重、鮮重量和根冠比指標的結合,從根質量到地上部質量全面的反映了棉花苗期生長發育情況,其數值的變化被廣泛用于評價鹽堿脅迫對棉花苗期生長發育的影響程度[32-33]。其中根是植物與鹽漬化土壤第一個直接接觸的器官,直接受到鹽堿脅迫的危害,其生長、形態都受到影響[34]。植物面對鹽堿脅迫形成了一定的適應機制,如通過減少地上部的生物量、減少水分和營養消耗等。因此植物地上部比地下部對鹽堿脅迫更為敏感[35],在一定鹽堿濃度范圍內根冠比的大小與受鹽堿脅迫程度以及植物耐鹽堿脅迫能力負相關[16,36]。在研究鹽堿脅迫濃度下,根冠比顯著高于對照組,HN9311通過增大根冠比來保證逆境情況下水分與營養的需求;除真葉數和根冠比以外,其余直接指標在鹽脅迫和堿脅迫情況下均顯著低于對照組,鹽/堿脅迫對HN9311苗期的生長發育也有顯著的影響。NaHCO3較NaCl能夠提供額外的pH脅迫[37-39],在含Na+離子濃度相同情況下,堿性土壤對植物的脅迫程度大于鹽性土壤。通過比較鹽/堿脅迫下各項直接指標下降程度,得到苗期堿脅迫對棉花生長的抑制程度大于鹽脅迫的結論,與蘇孟杞[40]研究一致。

3.4相對指標可以消除棉花品種導致的種間直接指標的差異,其數值大小可以評價不同品種棉花之間耐鹽堿脅迫能力差異[19,41]。研究發現,在同樣的鹽脅迫和堿脅迫條件下,除萌發期堿脅迫下相對下胚軸長和相對發芽指數,以及苗期堿脅迫下相對根冠比以外,HN9311萌發期和苗期所有相對指標均顯著小于或等于中棉所12號,并且相對根冠比同樣與耐鹽堿脅迫能力負相關,外來Bn-RRM2基因影響了棉花耐鹽/堿性,使其萌發期耐鹽脅迫能力和苗期耐鹽/堿脅迫能力均低于親本對照的。目前,分子層面上鹽堿脅迫對棉花生長發育的影響尚未被全面闡述[18],Bn-RRM2基因對棉花耐鹽堿脅迫能力的影響也有待于探索。相對鹽/堿害率可評價鹽/堿脅迫下植株被危害的等級[42],其數值越大棉花生長發育被抑制程度越大[20,43]。HN9311萌發期相對鹽/堿害率分別為27.00%、21.00%,中棉所12號分別為22.75%、23.00%,在試驗鹽/堿濃度下兩者受鹽/堿脅迫程度不大。由于HN9311相對鹽害率數值顯著大于中棉所12號,HN9311萌發期耐鹽脅迫能力顯著小于中棉所12號。

3.5在適宜鹽堿濃度下植物會加快萌發,當濃度超過閾值時鹽堿會抑制其生長[44]。棉花耐鹽閾值為77 mmol/L NaCl,采用150 mmol/L NaCl來鑒定棉花耐鹽性[44-46],研究鹽脅迫條件設定為150 mmol/L NaCl。鹽漬土形成的原因是多種因素共同作用的結果[47],其形成因素不穩定導致新疆各地區土壤中的鹽堿離子濃度差異較大[48],并且NaCl和NaHCO3是新疆鹽漬土壤中兩種并存的典型化合物[49]。單一濃度和單獨的鹽/堿脅迫設定不能全面反映土壤中的鹽堿對HN9311生長發育的影響,以后可設計多個濃度梯度并且增加NaCl+NaHCO3復合試驗來進一步完善研究結果。研究為室內試驗相較于田間試驗環境較為穩定,在田間試驗過程中HN9311的生長發育會受到多個因素如雨水、溫度等的影響,中棉所12號為鹽敏感品種[50-51],HN9311同樣為鹽敏感品種。鹽/堿脅迫對HN9311產量的影響可能較大,有待于進一步研究。

4 結 論

與中棉所12號相比,除真葉數和根冠比以外,HN9311萌發期和苗期各項直接指標均顯著下降,鹽/堿脅迫對HN9311生長發育均具有顯著的抑制作用并且其苗期對堿脅迫比鹽脅迫更為敏感。HN9311萌發期相對鹽/堿害率分別為27.00%、21.00%,中棉所12號分別為22.75%、23.00%,其萌發期耐鹽脅迫能力和苗期耐鹽/堿脅迫能力均低于中棉所12號。