灰棗擴展蛋白基因ZjEXPA8的克隆及序列分析

靳 娟,蘇比娜·肖克來提,阿布都卡尤木·阿依麥提,楊 磊,郝 慶,樊丁宇

(新疆農業科學院園藝作物研究所/農業部新疆地區果樹科學觀測實驗站,烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】棗(ZiziphusjujubaMill.)為鼠李科(Rhamnaceae)棗屬(Ziziphus)植物,是我國特有的經濟林樹種[1]。棗營養豐富,抗逆性強。新疆是我國最大的優質干棗產區,其中灰棗是最重要的主栽品種,但其自然坐果率較低[2]。研究灰棗的生長發育機理對改良灰棗品種和提高產量具有重要意義。對灰棗花進行轉錄組學研究,鑒定到一個擴展蛋白基因(Expansin-A8,ZjEXPA8)在花發育不同時期均上調表達[3],研究其序列特征,為分析ZjEXPA8基因在灰棗果實生長發育中的作用和功能奠定基礎。【前人研究進展】擴展蛋白是植物中一類重要的細胞壁蛋白,能夠打斷細胞壁多糖之間之間的非共價鍵,使細胞壁松弛,促進細胞伸展與分裂[4]。根據結構的不同,擴展蛋白基因家族被分為EXPA(Expansin A)、EXPB(Expansin B)、EXLA(Expansin-like A)和EXLB(Expansin-like B)四個亞家族[5],其中EXPA和EXPB是2個最大的亞家族[6]。蔡兆琴等[7]以甘薯為材料,對擴展蛋白基因IbEXPA4 進行克隆和表達分析,結果表明甘薯IbEXPA4基因的表達能促進塊根縱向和橫向生長,參與了甘薯塊根的生長調節。Bajwa等[8]在當地棉花品種NIAB 846上過表達GhEXPA8基因可以明顯促進棉纖維的伸長。趙灣灣等[9]研究發現,隨著果實成熟軟化程度提高,番木瓜CpEXPA2基因表達量也相應提高,該基因可能參與了番木瓜果實成熟軟化過程。擴展蛋白在植物的生長和發育中發揮著重要作用。【本研究切入點】目前,關于灰棗擴展蛋白基因調控果實發育的分子機理研究較少,前期在灰棗轉錄組學分析中發現ZjEXPA8基因在不同發育時期均上調表達,需該基因與灰棗果實生長發育相關性。【擬解決的關鍵問題】對ZjEXPA8基因進行克隆,并對其進行生物信息學分析,并采用實時熒光定量PCR技術檢測其在灰棗不同發育時期的表達情況,研究ZjEXPA8基因在灰棗果實生長發育中的作用,為灰棗遺傳改良和新品種培育提供理論基礎和基因資源。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 灰 棗

供試品種為灰棗,采集地點為新疆阿克蘇地區阿克蘇市試驗林場,樹齡10 年生,株行距2 m×4 m,樹形為自然開心形,棗園水肥投入到位,管理水平較好。分別采集蕾黃期、萼片展平期、花絲萎蔫期、子房膨大期和幼果期5個時期的棗花和幼果樣本。樣品采集后立即在液氮中冷凍,并保存在-80℃冰箱中備用。

1.1.2 主要試劑

植物多糖多酚總RNA提取試劑盒Quick RNA isolation Kit、反轉錄試劑盒Fasting RT Kit(With gDNA)、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質粒小量提取試劑盒和DL2000 DNA Marker購自北京天根生化科技有限公司;南京諾唯贊公司的2×TaqMaster Mix;pEASY-Blunt克隆載體和DH5α感受態細胞購自北京全式金公司;抗生素卡那霉素(Kan)購自上海生工生物工程有限公司;實時熒光定量PCR SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)試劑盒購自TAKARA公司;所用引物均在上海生工公司合成。其他試劑為國產分析純試劑。

1.2 方 法

1.2.1 總RNA提取和cDNA合成

采用植物多糖多酚總RNA提取試劑盒,按照說明書中的操作流程進行,提取不同發育時期灰棗花的總RNA,提取完成后,使用Nanophotometer-N60核酸檢測儀檢測所有樣品的RNA濃度與純度,再用1%的瓊脂糖凝膠電泳驗證RNA的完整性,篩選出質量提取質量較高的RNA樣品,保存于-80℃冰箱中。使用Fasting RT Kit(With gDNase)試劑盒將得到的總RNA模板反轉錄合成灰棗花的cDNA。

1.2.2 灰棗ZjEXPA8基因克隆

根據前期研究發布的灰棗轉錄組數據庫(PRJNA588582)篩選獲得目的基因ZjEXPA8,并在NCBI查找獲得ZjEXPA8基因的CDS序列,利用Primer Premier 5 軟件設計克隆引物,上游引物為5’-GTACCATGGCTAATATTTCTGCATA-3’(ZjEXPA8-F),下游引物為5’- GCGTCGACGAATTGGCTACCCTC-3’(ZjEXPA8-R)。以反轉錄得到蕾黃期的灰棗花cDNA為模板,利用2×TaqMaster Mix進行PCR擴增。PCR反應體系:cDNA 0.5 μL,ZjEXPA8-F和ZjEXPA8-R引物各1 μL,2×TaqMaster Mix 10 μL,ddH2O 補充反應體系至20 μL。反應條件為95℃ 3 min,95℃ 15 s,57℃ 20 s,72℃ 1 min,35個循環。利用DNA膠回收試劑盒對PCR產物進行回收,并將其連接至pEASY-Blunt載體上,并轉化到DH5α感受態細胞中,挑選陽性克隆送至上海生工生物工程有限公司測序。

1.2.3 生物信息學

通過在線軟件ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)對灰棗ZjEXPA8編碼的氨基酸進行分析,包括蛋白分子量和等電點等;利用ProtScale(https://web.expasy.org/protscale/)分析ZjEXPA8編碼蛋白的氨基酸序列的疏水性/親水性;利用NCBI的Conserved domains database數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)分析ZjEXPA8的結構域;用SOPMA軟件(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html)預測ZjEXPA8蛋白的二級結構;利用SWISS-Model(https://swissmodel.expasy.org/interactive)預測ZjEXPA8蛋白的三級結構;利用TMHMM 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預測跨膜域;利用DNAMAN軟件比對分析ZjEXPA8序列;用MEGA7.0軟件對不同物種的ZjEXPA8基因編碼的氨基酸序列以鄰接法來構建系統進化樹。

1.2.3 實時熒光定量PCR

根據已獲得的ZjEXPA8基因序列,設計實時熒光定量PCR引物,上游引物為5’- ATGCCGGATCTAAGCCCTCT -3’(QZjEXPA8-F),下游引物為5’-CATACCCACAAGCACCTCCCAT’ (QZjEXPA8-R)。以棗ZjActin為內參基因,將不同發育時期灰棗花和幼果期的cDNA為模板,采用qTOWER3G熒光定量PCR儀檢測ZjEXPA8基因在不同發育時期灰棗花和幼果中的表達水平,用內參基因檢測擴增效率一致性。熒光定量反應體系為cDNA 1 μL,QZjEXPA8-F和QZjEXPA8-R引物各0.5 μL,2×SuperReal PreMix Plus 10 μL,ddH2O 補充反應體系至20 μL。反應條件為95℃ 15 min,95℃ 10 s,55℃ 30 s,72℃ 20 s,40個循環,重復3次。實時熒光定量數據采用2-ΔΔCt法進行分析計算。用GraphPad Prism 7.0軟件進行數據處理和作圖。

2 結果與分析

2.1 灰棗ZjEXPA8基因克隆

研究表明,灰棗ZjEXPA8基因包含一個長度為762 bp的開放閱讀框,編碼253個氨基酸,以ATG 為起始密碼子,TAG為終止密碼子。圖1,圖2

注:M.DL2000 DNA Marker;1, 2: ZjEXPA8

2.2 灰棗ZjEXPA8基因的生物信息學

研究表明,ZjEXPA8蛋白中甘氨酸Gly含量最高,占全部氨基酸的13.8%;而谷氨酸Glu,組氨酸His和甲硫氨酸Met含量相對較少,分別占全部氨基酸的0.8%,1.6%和1.6%。灰棗ZjEXPA8帶負電荷氨基酸殘基(Asp+Glu)總數為10,帶正電荷氨基酸殘基(Arg+Lys)總數為13;不穩定系數為30.09,屬于穩定蛋白。預測ZjEXPA8基因編碼的氨基酸序列的分子式為C1192H1787N327O360S14,分子量為 26.91 kDa,等電點為8.32。表1

表1 ZjEXPA8編碼蛋白的氨基酸組成

灰棗花ZjEXPA8基因編碼的氨基酸中,第13位的氨基酸殘基的疏水性均最強,為2.933,第207位的氨基酸殘基親水性最強,為-2.322。該蛋白脂肪指數為66.72,總親水性平均數為-0.107,預測ZjEXPA8屬于親水蛋白。圖3

圖3 ZjEXPA8編碼蛋白親水/疏水性的預測

ZjEXPA8基因編碼的253個氨基酸中,無規則卷曲占比最高,為51.78%,α螺旋占15.81%,延伸鏈占23.32%,β-轉角占9.09%,與SWISS-MODEL三維建模的結果相吻合。該蛋白含有DPBB_1和Pollen_allerg_1 2個保守結構域。該蛋白沒有跨膜域。圖4～6

圖5 ZjEXPA8蛋白的三級結構預測

圖6 ZjEXPA8蛋白質保守結構域預測

2.3 灰棗ZjEXPA8基因的同源序列比對及系統進化樹構建

研究表明,灰棗ZjEXPA8基因編碼的氨基酸序列與大豆(Glycinemax,XP_003523276.1,GmEXPA8)的相似性最高,為93.13%;與蔓花生(Arachisduranensis,XP_015945084.1,AdEXPA8)、木薯(Manihotesculenta,XP_021617395.1,MeEXPA8)、柱花草(Stylosanthesguianensis,QHQ74416.1,SgEXPA8)、橡膠(Heveabrasiliensis,XP_021684783.1,HbEXPA8)、蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula,XP_013461515.1,MtEXPA8)、麻風樹(Jatrophacurcas,XP_012091147.1,JcEXPA8)、巨桉(Eucalyptusgrandis,XP_018732353.2,EgEXPA8)、番櫻桃(Syzygiumoleosum,XP_030441410.1,SoEXPA8)、阿月渾子(Pistacia vera,XP_031271261.1,PvEXPA8)、甜橙(Citrus sinensis,KAH9702866.1,CsEXPA8)、楊梅(Morellarubra,KAB1217588.1,MrEXPA8)、番木瓜(Caricapapaya,XP_021904225.1,CpEXPA8)和棉花(Gossypiumhirsutum,XP_016686328.1,GhEXPA8)的相似性分別為92.03%、90.76%、90.44%、90.12%、90.04%、89.60%、89.24%、88.93%、88.80%、88.58%、88.40%、87.80%和7.80%。與模式植物擬南芥(Arabidopsisthaliana,NP_181593.1,AtEXPA8)的相似性最低,為78.74%。圖7

圖7 ZjEXPA8的氨基酸序列與其他植物EXPA8氨基酸序列比對

灰棗ZjEXPA8基因與橡膠(Heveabrasiliensis,XP_021684783.1,HbEXPA8)和擬南芥(Arabidopsisthaliana,NP_181593.1,AtEXPA8)的親緣關系最近。圖8

圖8 ZjEXPA8蛋白序列的系統進化

2.4 灰棗ZjEXPA8基因表達

研究表明,灰棗ZjEXPA8基因在棗花發育不同時期(蕾黃期、萼片展平期、花絲萎蔫期、子房膨大期)和幼果期均有表達,蕾黃期表達量最高,萼片展平期次之,該基因可能主要在蕾黃期和萼片展平期發揮作用。圖9

注:L.蕾黃期;H.萼片展平期;S.花絲萎蔫期;G.子房膨大期;Y.幼果期

3 討 論

3.1棗(ZiziphusjujubaMill.)是我國重要栽培果樹和生態樹種[10]。目前在全疆59個縣市區廣泛種植。2019年底[11]新疆紅棗種植面積44.52 ×104hm2(含兵團10.04×104hm2)、產量372.77×104t(含兵團200.33×104t)。灰棗是新疆栽培面積最大的主栽品種,其花量大,但落花落果嚴重,自然坐果率極低[2]。

3.2ZjEXPA8基因在花發育不同時期均上調表達,其可能在灰棗果實生長調控中發揮重要作用[3]。研究利用RT-PCR方法克隆獲得灰棗擴展蛋白ZjEXPA8基因,該基因全長為762 bp,編碼253個氨基酸,蛋白分子量為 26.91 kDa,不穩定系數為30.09,總親水性平均數為-0.107,屬于穩定親水蛋白。ZjEXPA8蛋白的結構進行分析含有DPBB_1和Pollen_allerg_1兩個保守結構域,與甘薯IbEXPA4蛋白的結構相似[7],其屬于EXPA 亞家族。同源序列比對結果顯示,ZjEXPA8蛋白與大豆GmEXPA8的相似度最高,達93.13%,蔓花生AdEXPA8次之,相似度達92.03%。系統進化樹分析表明,ZjEXPA8基因與橡膠HbEXPA8和擬南芥AtEXPA8基因的親緣關系最近。

3.3擴展蛋白在植物的生長和發育過程中扮演著重要角色[12]。擴展蛋白參與種子萌發[13]、葉片生長[14]、根系發育[15]、花芽發育[16]、果實成熟[17]等多個生物學過程。研究中,灰棗ZjEXPA8基因在棗花發育不同時期均有表達,蕾黃期表達量最高,萼片展平期次之,該基因可能主要在蕾黃期和萼片展平期發揮作用。研究探明了灰棗ZjEXPA8的基因序列和結構特征,但是該基因在灰棗果實發育過程中的調控作用和功能還有待于進一步的深入研究。

4 結 論

克隆獲得了灰棗擴展蛋白ZjEXPA8基因,開放閱讀框為762 bp,編碼253個氨基酸,蛋白分子量為 26.91 kDa。ZjEXPA8基因編碼的蛋白與大豆GmEXPA8的同源性最高,親緣關系上與橡膠HbEXPA8和擬南芥AtEXPA8最近。ZjEXPA8基因在灰棗花蕾黃期表達量最高。