高溫脅迫下陸地棉GhCIPK6轉基因后代生理生化分析

王 輝,郭金成,宋 佳,張庭軍,何良榮

(1.塔里木大學農學院,新疆阿拉爾 843300;2.新疆生產建設兵團第六師農業科學研究所,新疆五家渠 831300)

0 引 言

【研究意義】高溫脅迫造成作物的經濟損失越來越嚴重[1]。預計全球氣溫每10年將上升0.2℃[2]。植物的生長和發育過程受到高溫(HT)脅迫的嚴重影響[3,4]。高溫會導致作物的光合作用等生理活動受到嚴重影響,并影響植株的正常生長和發育,是作物減產的主要影響因素[5]。【前人研究進展】在高溫脅迫下,一般先受到破壞的是細胞質膜的結構和功能[6]。高溫影響細胞膜的穩定性,氣體交換(光合作用、光呼吸作用、蒸騰作用、氣孔導度)及相關酶的活性[7]。植物細胞在高溫逆境下利用多種方式產生活性氧造成氧化脅迫,但一定程度的高溫脅迫往往會促使產生較高水平的耐熱性,但當高溫脅迫超出一定范圍后,活性氧生成速率加快,與此同時非酶性清除劑含量不斷減少、活性氧酶性消除系統活性也在不斷降低,這樣就導致大量活性氧不能被有效清除,進而造成氧化傷害[8]。【本研究切入點】植物體內的存在的一類微量植物激素,如脫落酸(Abscisic acid,ABA)、生長素(Auxin,IAA),水楊酸(Salicylic acid,SA)、茉莉酸(Jasmonic acid,JA)等。植物受到逆境脅迫時,體內的激素發生變化,通過影響植物的生理生化活動來產生抵御脅迫的能力[9]。需開展關于植物對熱脅迫的響應和防御方面的研究,了解陸地棉在生理生化水平上對高溫脅迫的響應機理和抵御機制。【擬解決的關鍵問題】選擇轉基因材料超表達和、RNAi和野生型材料,測定3種材料測定不同時間、不同環境下生理生化指標變化,為研究陸地棉抗高溫分子機理提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

材料為陸地棉品系YZ1,由華中農業大學育種實驗室構建GHCIPK6超表達和RNAi載體,遺傳轉化棉花品系YZ1,分別得到超表達和干涉的轉基因純系。RN代表正常溫度RNA干涉材料,RH代表高溫RNA干涉材料;WN代表正常溫度野生型材料,WH代表高溫野生型材料;ON代表正常溫度超表達材料,OH代表高溫超表達材料。

1.2 方 法

1.2.1 試驗設計

將棉花材料每株系種植90株以上,培養室中培養,培養條件設定為相對濕度RH=80%,光周期14 h/10 h 白天/夜晚,光密度500 μmol/(m2·S),全程充分供水。待植株長大到第6周,將棉花植株轉入生長箱中。對照組生長條件保持不變,處理組42℃熱脅迫24 h,在26℃恢復24 h,處理及對照組分別于4、12、24和48 h取樣,每個時間點分2個生物學重復,每個重復5株幼苗。

1.2.2 測定指標

1.2.2.1 光合特性

使用美國LI-COR公司生產的Li-6400XT便攜式光合作用測量系統測定正常溫度和高溫下不同時間段棉花幼苗的凈光合速率(Pn)、氣孔導度(Gs)、蒸騰速率(Tr)、細胞間CO2濃度(Ci),使用SPAD測定儀(SPAD-502PLUS)測定葉綠素相對含量。

1.2.2.2 抗性相關

丙二醛(MDA)含量測定采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法[10],過氧化物酶(POD)活性測定采用愈創木酚顯色法,可溶性蛋白含量的測定采用考馬斯亮藍染色法,脯氨酸(Pro)的測定方法采用茚三酮顯色法[11],超氧化物歧化酶(SOD)活性測定采用氮藍四唑(NBT)比色法[12]。

1.2.2.3 植物激素

激素測定所用的儀器為液質聯用系統4000 Q-TRAR LC-MS(Applied Biosystems,USA)

1.3 數據處理

數據分析用WPS office Excel軟件,采用統計軟件DPS進行單因素方差分析及數據顯著性檢驗和SPSS 21分析數據。

采用主成分分析對試驗中各個時期的14個相關生理指標平均值進行綜合評價。根據各主成分的得分,及各主成分的方差貢獻率為權數,對所提取的得分進行加權求和,得到各材料高溫下的綜合得分。

2 結果與分析

2.1 高溫脅迫下陸地棉幼苗葉片比較

研究表明,4 h時,在正常溫度26℃下,3種材料幼苗葉片正常生長,無任何變化,在高溫42℃下,超表達第1片真葉和第2片真葉明顯下垂枯萎,第3片真葉也出現下垂,RNAi和野生型第1片真葉和第2片真葉下垂不明顯,第3片真葉無變化。在48 h時,取下對照溫度和高溫的葉片,進行比較,超表達葉片已經發黃,葉片上已出現大量斑點,野生型葉片發黃程度次之,RNAi葉片只輕微發黃。圖1

注:A、B分別代表4 h正長溫度和高溫幼苗,C代表48 h幼苗葉片

2.2 高溫脅迫下陸地棉光合特性

2.2.1 高溫脅迫下陸地棉凈光合速率(Pn)變化

研究表明,光合作用是棉花生長發育必要條件,也是增加產量的必要因素,而凈光合速率是光合作用的最直接體現。在4 h,野生型進行光合速率快,而超表達材料較慢;在12 h,三者均在正常溫度下進行光合速率快,高溫下較慢;在24 h,三者在正常溫度下進行光合速率大于三者高溫下,其中超表達高溫光合速率能力最低,在48 h,野生型正常溫度和高溫下不顯著,RNAi在高溫下與正常溫度下達到顯著,超表達在正常溫度和高溫下光合速率能力低。超表達相對其他兩種材料,光合速率較慢。圖2

注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05),下同

2.2.2 高溫脅迫下陸地棉氣孔導度(Gs)的變化

研究表明,氣孔的保衛細胞受到外界環境的刺激能迅速做出反應,在高溫脅迫下,植物氣孔的保衛細胞產生應激反應打開氣孔,CO2進入植物的量增多,從而導致葉片光合速率增加。超表達材料在整個時期氣孔導度能力很低,在12 h時,3種材料氣孔導度在高溫下達到最低,氣孔關閉,隨著脅迫時間延長,氣孔導度逐漸增大,在脅迫超過一定時間,氣孔打開,光合速率增加,光合作用增強。超表達材料相對其他兩種材料,氣孔導度減弱,超表達材料進行光合作用能力差。圖3

圖3 高溫脅迫下氣孔導度的變化

2.2.3 高溫脅迫下陸地棉蒸騰速率(Tr)的變化

研究表明,蒸騰作用能夠對外界環境做出反應來進行自我保護,在一定溫度下,蒸騰作用可降低葉片溫度,降低水分散失,增強對礦物質的吸收。在正常溫度下12 h時,RNAi株系的蒸騰速率為1.33 mmolH2O/(m2·s),野生型株系蒸騰速率為1.14 mmolH2O/(m2·s),而高溫下,RNAi蒸騰速率為0.64 mmolH2O/(m2·s),野生型株系蒸騰速率為0.35 mmolH2O/(m2·s);48 h時,高溫處理下各材料蒸騰速率加快,RNAi為1.64 mmolH2O/(m2·s),野生型為1.42 mmolH2O/(m2·s),正常溫度下蒸騰速率減慢,RNAi為0.84 mmolH2O/(m2·s),野生型為0.68 mmolH2O/(m2·s)。高溫處理下,隨著時間延長,蒸騰速率增加,可以降低葉片溫度,減少水分散失,增強對礦物質的吸收。超表達株系從4 h到48 h先降低在增加,在整個時期蒸騰速率緩慢。圖4

圖4 高溫脅迫下蒸騰速率的變化

2.2.4 高溫脅迫下陸地棉細胞間CO2濃度(Ci)的變化

研究表明,從4 h到12 h時,RH由303 μmol/mol下降到298 μmol/mol,WH由280 μmol/mol下降到262 μmol/mol,RNAi干擾株系和野生型株系胞間CO2濃度在高溫下并沒有急劇下降,氣孔導度下降,凈光合速率下降的主要因素并不是氣孔閉合,而超表達株系(4 h到12 h時)在高溫下急劇下降,OH由248 μmol/mol下降到199 μmol/mol,高溫下超表達株系敏感性強。圖5

圖5 高溫脅迫下胞間CO2濃度的變化

2.2.5 高溫脅迫下陸地棉葉綠素相對含量(SPAD)的變化

研究表明,隨著時間延長,3種株系的葉綠素含量變化較小,其中RH葉綠素含量為30.5、30.1、30.3、34.1,WH葉綠素含量為29.5、30.3、30.3、32.9,OH葉綠素含量為28.2、27.8、27.6、29.3,在高溫脅迫下,SPAD值不會受溫度影響仍能保持高含量,從而進行光合作用。圖6

圖6 高溫脅迫下葉綠素相對含量的變化

2.3 高溫脅迫下陸地棉抗性

2.3.1 高溫脅迫下陸地棉丙二醛(MDA)的變化

研究表明,在正常溫度下,3種株系隨著時間延長,丙二醛含量呈先增加再降低后增加。在高溫下,隨著時間延長,RNAi干擾株系中丙二醛含量呈先增加后下降,野生型株系中丙二醛含量呈逐漸緩慢增加,而超表達株系丙二醛含量逐漸增加,其中48 h時達到最大為0.06 μmol/g,超表達株系在高溫脅迫下對膜造成的傷害大,對棉花細胞活力起到抑制作用。圖7

圖7 高溫脅迫下MDA含量的變化

2.3.2 高溫脅迫下陸地棉氧化物酶(SOD)、超氧化物歧化酶(POD)的變化

研究表明,在正常溫度下,RNAi干擾株系和野生型株系SOD活性相對較高,超表達株系中SOD活性先降低后增加。在高溫下,隨著時間延長,RNAi干擾株系中SOD活性呈先增加后下降,野生型株系和超表達株系中SOD活性呈先降低再上升后降低,超表達株系在整個時期都相對較低,分別為3.1、1.8、2.9、2.3 μ/mg,在正常溫度下,RNAi干擾株系和野生型株系中SOD活性對于清除自由基能力較強保護膜質過氧化,在高溫下,超表達株系中SOD活性對于清除自由基能力較差,未能減輕細胞膜的損壞。圖8

圖8 高溫脅迫下SOD活性的變化

在正常溫度下,3種株系POD活性隨時間延長逐漸增加,其中超表達株系POD活性在整個時期含量較高。在高溫下,RNAi干擾株系和野生型株系隨著時間延長,SOD活性趨于平衡,而在超表達株系在整個時期都達到最大值,分別為222、239、199、220 μ/(mg·FW),超表達株系通過提高POD活性來應對熱脅迫。受到高溫脅迫,在整個時期超表達株系SOD活性較低,而POD活性較高,在應對高溫環境SOD、POD表現出不同的變化,發揮自身功能,應對高溫脅迫表現出不同的作用。圖9

圖9 高溫脅迫下POD活性的變化

2.3.3 高溫脅迫下陸地棉可溶性蛋白的變化

研究表明,3種株系在正常溫度下可溶性蛋白含量相對較低,在48 h達到了最低,RN為0.71 mg/g,WN為0.88 mg/g,ON為1.38 mg/g。而在高溫下,隨著時間延長,RNAi干擾株系中可溶性蛋白含量呈先降低后增加,分別為5.87、3.95、2.87、4.49 mg/g,野生型株系可溶性蛋白含量先增加再降低后增加,分別為5.02、7.28、2.40、6.70 mg/g,超表達株系中可溶性蛋白含量呈先增加后降低,分別為4.99、5.15、6.30、5.68 mg/g,在高溫誘導下,可溶性蛋白含量較高。圖10

圖10 高溫脅迫下可溶性蛋白含量的變化

2.3.4 高溫脅迫下陸地棉脯氨酸(Pro)的變化

研究表明,在正常溫度下,3種株系的脯氨酸含量隨著時間延長逐漸增加,而在高溫下,野生型株系和超表達株系脯氨酸含量從4～12 h緩慢上升,12～48 h下降,RNAi干擾株系的脯氨酸含量隨著時間逐漸降低,超表達株系在整個時期脯氨酸含量相對較高,分別為34.32、36.39、34.91、30.97 μg/g,熱脅迫對超表達株系造成嚴重傷害,從而通過脯氨酸含量的積累應對逆境。圖11

圖11 高溫脅迫下脯氨酸含量的變化

2.4 高溫脅迫下陸地棉植物激素

2.4.1 高溫脅迫下陸地棉生長素(IAA)的變化

研究表明,在正常溫度下,RNAi干擾株系和野生型株系隨著時間延長生長素含量趨于平衡,超表達株系中生長素含量逐漸上升。在高溫下,RNAi干擾株系中生長素含量呈先下降后上升,變化為7.59、7.02、9.20、10.31 ng/g,野生型株系W中生長素含量呈先上升后下降,變化為6.77、7.06、10.53、7.86 ng/g,超表達株系OE中生長素含量逐漸升高,變化為6.83、8.19、9.28、9.70 ng/g。隨著時間延長,生長素不受高溫影響,能夠抵御高溫環境。RNAi干擾株系和超表達株系隨著時間延長體內生長素含量逐漸增加。圖12

圖12 高溫脅迫下生長素含量的變化

2.4.2 高溫脅迫下陸地棉脫落酸(ABA)的變化

研究表明,正常溫度下,3種株系在整個時期脫落酸含量呈現先增加在下降。高溫下,超表達株系和野生型株系隨著時間延長,脫落酸含量先增加再下降后上升,野生型株系上升的幅度較大,超表達株系則上升幅度較小,而RNAi干擾株系脫落酸含量先增加后下降。超表達株系在整個時期脫落酸含量相對較低,常溫處理4個時間段分別為84.80、148.68、94.45、126.64 ng/g,而高溫處理時分別為165.71、195.34、147.47、162.46。高溫脅迫時,超表達株系OE中的脫落酸因未能迅速做出反應來提高植物抗性。圖13

圖13 高溫脅迫下脫落酸含量的變化

2.4.3 高溫脅迫下陸地棉茉莉酸(JA)的變化

研究表明,正常溫度下隨著時間延長,野生型株系中茉莉酸含量呈先增加后下降,RNAi干擾株系中茉莉酸含量逐漸增加,超表達株系茉莉酸含量先增加再下降后上升。高溫下,3種株系隨著時間延長體內茉莉酸含量呈現先增加后下降。圖14

圖14 高溫脅迫下茉莉酸含量的變化

2.4.4 高溫脅迫下陸地棉水楊酸(SA)的變化

研究表明,正常溫度下,3種株系隨著時間延長水楊酸含量呈先上升再下降后上升,在整個時期,超表達株系OE中水楊酸變化幅度較為明顯,分別為22.56、94.16、31.54、37.60 ng/g,其中在12 h達到最大值。高溫下,RNAi干擾株系和野生型株系中水楊酸含量呈先下降再上升后下降,RNAi分別為19.10、12.41、53.33、23.24 ng/g,野生型W分別為18.50、13.91、37.93、19.10 ng/g,超表達株系高溫脅迫中水楊酸含量呈先上升后下降,分別為33.19、40.51、48.42、20.21 ng/g。高溫脅迫前期,超表達株系可以通過增加水楊酸含量來實現對植物抗逆保護,但48 h下降為20.21 ng/g,保護作用下降。圖15

圖15 高溫脅迫下水楊酸含量的變化

2.5 高溫脅迫下陸地棉綜合評價

研究表明,得到各植物種測定指標成分的特征值、貢獻率和累計貢獻率,得到4個主成分可以解釋全部方差的84.587%,提取前4個主成分可以代表14個高溫下指標信息的84.94%。在第1主成分分析中,光合作用指標的貢獻率較大,其中蒸騰速率最大,過氧化物酶最低;第2主成分分析中,生長素的貢獻率較大,水楊酸次之;在第3主成分分析中,丙二醛含量的貢獻率最大;第4主成分分析中,脯氨酸含量的貢獻率最大。蒸騰速率可視為反映植物抗高溫性能的最重要生理生化指標,其次是生長素含量、丙二醛含量和脯氨酸含量。表1

表1 主成分因子載荷矩陣及主成分特征根

排序排在前3的是RNAi中的48 h,野生型的48 h和4 h,3種材料抗高溫能力由強到弱為:RNAi,野生型,超表達,RNAi綜合得分為0.201,野生型綜合得分為0.135,超表達綜合得分為-0.337。表2

表2 主成分得分及綜合評價

3 討 論

3.1 高溫脅迫對陸地棉光合特性的影響

氣孔是植物與環境進行物質交換的通道,氣孔通過調節其開閉狀態,控制著CO2進入植物體內及水分從體內的散失[13]。可溶性蛋白具有滲透調節的作用,還能夠在一定程度防止細胞質脫水[14]。脯氨酸具有調節滲透及保護細胞結構穩定的作用[15]。脫落酸具有促進植物休眠、抑制生長、促進氣孔關閉和增加抗逆的作用[16]。茉莉酸作為一種重要的新型植物內源激素,通過信號傳遞來調控植物防御反應和抗逆發揮著重要作用[17]。水楊酸作為植物產生系統獲得性抗性的內源信號, 當植物受到非生物因素影響時, 植物體局部水楊酸含量增加,促進抗逆蛋白合成、提高滲透調節能力和抗氧化能力,并伴有一些防衛相關蛋白的表達[18]。光合作用是一切生物直接或間接的能量來源,是植物進行物質轉換和能量代謝的關鍵[19]。引起植物凈光合速率下降的原因主要分為氣孔因素和非氣孔因素,氣孔限制因素引起的Pn下降表現為Gs、Ci、Tr的下降,非氣孔限制因素引起的Pn下降表現為Tr、Gs下降的同時Ci升高[20,21]。研究中隨著時間延長凈光合速率Pn呈先下降后上升的同時氣孔導度Gs、蒸騰速率Tr、細胞間CO2濃度Ci均也呈先下降后上升,Pn的變化是由氣孔限制因素所導致的,與竇飛飛[22]結論一致。

3.2 高溫脅迫對陸地棉光抗性相關的影響

在高溫下,RNAi氧化物酶呈先上升后下降,而超表達和野生型材料先下降再上升后下降,隨著時間延長,體內的氧化物酶都在下降,可能導致酶活性下降,也有相關研究在馬鈴薯和大白菜中發現同樣的規律[23,24]。超氧化歧化酶活性與氧化物酶活性不同,RNAi和野生型材料在高溫下大致趨于平衡,可能由于超氧化歧化酶活性不受環境影響,在高溫下對植物進行保護,而超表達材料超氧化歧化酶活性異常顯著,敏感性材料會大量產生超氧化歧化酶。3種材料隨著時間延長,體內丙二醛含量逐漸增加,其中超表達材料在48 h丙二醛含量達到最大值,且不同材料耐熱性存在顯著差異,與王倩[25]研究結論相似。脯氨酸具有阻止細胞膜透性的作用,在高溫脅迫下,隨著時間延長,脯氨酸含量逐漸降低,與前人研究結果相反,隨著時間延長,脯氨酸調節細胞滲透的功能下降,抗熱脅迫能力減弱。在溫度脅迫下,植物體內通過提高可溶性蛋白含量來增強本身的抗逆性[26],研究3種材料在高溫下,可溶性蛋白含量在整個時期相對較高,可溶性蛋白遇到高溫誘導產生熱激蛋白來增加植物的的抗逆性。

3.3 高溫脅迫對陸地棉植物激素的影響

植物內源激素在植物應對環境變化時起重要作用,內源激素水平、合成和分布會受溫度的影響而發生改變,多種植物內源激素參與植物應對逆境脅迫時的信號轉導[27]。在高溫下,RNAi和超表達材料生長素含量相對呈上升趨勢,提升植物耐受性,與王日明[28]研究結果相似,野生型材料生長素含量隨著時間延長呈現先上升后下降,說明野生型抗熱性差。楊長琴等[29]研究結果顯示高溫脅迫下棉花葉片中ABA含量隨著時間的延長呈先升后降的趨勢,研究在高溫下,超表達和野生型材料隨著時間延長脫落酸含量呈先上升再下降后上升,RNAi材料隨著時間延長,脫落酸含量先上升后下降,植物不一定總是通過提高ABA水平來抵抗高溫脅迫。隨著高溫脅迫時間的延長,3種材料茉莉酸含量先升后下降,與宋悅[30]研究結果相似。RNAi和野生型材料在高溫下,隨著時間延長水楊酸含量呈先下降再上升后下降,超表達隨著時間延長先上升后下降,可能由于前期水楊酸促進抗逆蛋白合成來增加抗逆性,但隨著時間延長,植物需求水楊酸逐漸增大,致使水楊酸含量逐漸降低。

3.4 高溫脅迫下陸地棉綜合評價

植物響應高溫是由體內各種機制共同制約環,僅憑一個指標來評價植物耐熱性是有很大的局限性[31]。研究結果表明,RNAi耐熱性最強,其次野生型,超表達耐熱性最差。

4 結 論

3種材料抗高溫能力由強到弱為RNAi,野生型材料,超表達材料。在高溫下可通過提高蒸騰速率來減弱逆境脅迫的危害,提高生長素含量來積極調控植物生長,提高細胞的滲透調節能力來減輕細胞遭受的損傷。