乳腺癌腦轉移差異基因的生物信息學分析*

吳雙麗,徐敬宣,邢 龍△

(青島濱海學院附屬醫院:1.神經內科;2.腫瘤內科,山東 青島 266500)

腦轉移是一個毀滅性的惡性腫瘤并發癥,影響約20%的癌癥患者[1]。乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤,近年來隨著新療法的引入,乳腺癌的治療發生了巨大變化。但是由于患者生存期的延長及血腦屏障的存在,腦轉移的發病率持續上升,這給腫瘤學專家帶來了挑戰,同時也導致患者生存時間和生存質量顯著下降[2]。從歷史上來看,將患有腦轉移的乳腺癌患者排除在臨床試驗之外,使得治療選擇更加有限。低存活率及較高的致殘率迫使人們尋找新的治療方法,以提高治療成功的概率。近年來,分子靶向藥物在眾多惡性腫瘤的治療中取得了驕人的成績,但分子靶向治療在乳腺癌腦轉移中研究尚少,因此研究乳腺癌腦轉移發生、發展的分子機制,進而制定有針對性的治療策略將造福眾多乳腺癌腦轉移患者。微陣列技術已被用于眾多惡性腫瘤的致癌基因研究中,發現了許多具有重要科研及臨床價值的核心基因,本研究通過對乳腺癌腦轉移組織基因芯片進行生物信息學分析,以期發現具有與患者預后相關核心基因。

1 材料與方法

1.1基因芯片數據集選取 以“breast cancer”和“brain metastases”為檢索詞在線數據庫GEO(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)上檢索基因芯片數據集,從檢索出的數據集中選取GSE1259892(平臺:GPL571HG-U133A_2] Affymetrix Human Genome U133A 2.0 Array)進行研究,該芯片集中有乳腺癌組織及乳腺癌腦轉移組織樣本各16例。

1.2方法

1.2.1篩選差異基因 分別通過在線工具GEO2R(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r)選出芯片集中乳腺癌腦轉移組織與乳腺癌組織的差異表達基因(DEGs)。篩選條件為|logFC|>2和校正P<0.05。以logFC>2、logFC <-2作為上下調基因的篩選標準。

1.2.2DEGs的KEGG和GO富集分析 通過在線數據庫DAVID(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)對篩選得到的DEGs進行GO(Gene Ontology)功能富集分析和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路富集分析,以校正P<0.05為差異有統計學意義。GO功能富集分析主要包括生物過程(BP)、細胞成分(CC)、和分子功能(MF)。

1.2.3PPI網絡構建及核心基因篩選 使用在線工具STRING構建DEGs的蛋白互作網絡(PPI),并利用CytoHubba 插件進一步對差異基因編碼蛋白相互作用進行可視化處理,利用CytoHubba插件篩選度(Degree)位于前10位的為核心基因。

1.2.4核心基因生存分析 將10個核心基因導入在線工具Kaplan-Meier Plotter(http://kmplot.com/an-alysis/index.php?p=background)選擇OS進行生存分析,以P<0.05為條件篩選出與預后明顯相關的核心基因。

2 結 果

2.1篩選差異表達基因 將芯片結果標準化后,鑒定出GSE125989中共篩選出72個DEGs,其中上調基因6個,下調基因66個。見表1。

表1 差異表達基因

2.2差異基因GO及KEGG富集分析 GO功能注釋顯示BP在細胞外基質組織、膠原原纖維組織、細胞黏附等方面顯著富集;CC主要在胞外區、細胞外基質、細胞外的外來體等方面顯著富集;MF主要在細胞外基質結構成分、細胞外基質具有抗拉強度的結構成分、膠原結合區等方面顯著富集。見圖1A。KEGG通路主要在蛋白質消化吸收、ECM受體的交互作用、癌癥中的蛋白聚糖等方面富集(圖1B)。

圖1 差異基因GO和KEGG富集分析

2.3PPI蛋白互作網絡構建 STRING數據庫構建DEGs的PPI網絡,并利用CytoHubba 插件以進一步對DEGs編碼蛋白相互作用進行可視化處理,上、下調的基因被標記為紅色和綠色(圖2)。利用 CytoHubba 插件以度來篩選 PPI 網絡中相互作用排名前10 位的 DEGs 作為核心基因。見圖3。

圖2 PPI網絡互作圖

圖3 核心基因PPI網絡互作圖

2.4核心基因生存分析 使用在線工具Kaplan-Meier Plotter進行生存分析,得到核心基因與患者總生存期(OS)關系,其中DCN、ELN與患者OS具有顯著相關性。見圖4。

圖4 核心基因生存分析

3 討 論

目前,腦轉移瘤的確切發生率尚不清楚,但由于現有治療手段的進步使得許多癌癥患者生存期更長、預后更好;另外,監測成像技術的使用、人口老齡化、人群健康意識提高及腫瘤學家的認識水平提高,腦轉移瘤的發生率正在逐步上升,腦轉移的發生率在實體腫瘤患者中約占30%。此外,尸檢隊列的數據表明,腦轉移瘤的真實發生率在某些原發癌患者中較高[3-4]。惡性腫瘤中最易出現腦轉移瘤的前3位是肺癌、乳腺癌和黑色素瘤,約占全部腦轉移瘤的67%～80%[5]。流行病學結果顯示,小細胞肺癌或非小細胞肺癌患者在診斷時有較高的腦轉移率,而黑色素瘤患者則有較高的腦轉移風險[6]。盡管腦轉移在兒童中很少見,但在兒童神經母細胞瘤、肉瘤、腎母細胞瘤、黑色素瘤和生殖細胞腫瘤患者中都表現出較高的腦轉移的傾向[7-8]。

DCN(decorin )一方面可抑制腫瘤細胞的增殖、轉移,另一方面可抑制腫瘤組織中的血管生成[9]。有研究發現,肺腺癌組織中DCN表達顯著降低,進一步細胞增殖實驗表明,對肺腺癌細胞系A549和H157細胞的DCN進行過表達處理,細胞系的增殖速率可被顯著抑制[10]。HU等[11]研究發現,DCN在炎性乳腺癌患者的腫瘤組織中表達顯著下調,在IBC異種移植小鼠模型中,過表達DCN可通過破壞E-cadherin的穩定性和抑制EGFR/ERK信號通路減弱腫瘤細胞的侵襲及遷移能力。ZHAO等[12]通過將一種基于DCN蛋白研制的溶瘤毒素(rAd.DCN),通過對免疫活性乳腺腫瘤模型瘤內和靜脈給予rAd.DCN,發現與靜脈輸注相比,瘤內注射rAd.DCN可產生更高水平的轉基因表達,誘發更強的腫瘤溶瘤作用,而靜脈輸注可導致肺部病毒積聚量增加,可起到防止腫瘤肺轉移的作用,肺組織中DCN的表達增加了Th1細胞因子的表達,如白細胞介素(IL)-2、IL-12和腫瘤壞死因子α,降低了Th2細胞因子的表達,如轉化生長因子β和IL-6。此外,rAd.DCN治療可誘導強烈的全身炎癥反應和上調CD8+T淋巴細胞,提示rAd.DCN在抑制乳腺癌細胞生長的同時可抑制肺轉移的發生。另外,還有學者研究發現,在三陰性乳腺癌小鼠模型中,在高劑量照射下腫瘤周圍肌肉比常規照射下分泌更多的DCN,提示腫瘤周圍肌肉分泌的DCN可能是超分割放療能更有效抑制TNBC生長的原因之一[13]。此外,DCN表達上調可減弱三陰性乳腺癌的肺轉移。

ELN編碼的蛋白為彈性蛋白,是彈性纖維的主要成分。在許多惡性腫瘤中,重建的ECM表達高水平的彈性蛋白,這可能對腫瘤的生長有積極或消極的影響。彈性蛋白與其他ECM組分的交聯以及控制這一過程的酶都對腫瘤的發生有影響。彈性蛋白酶的中性粒細胞彈性蛋白酶,是腫瘤入侵和轉移的關鍵驅動因素[14]。LI等[15]研究發現,彈性蛋白是結直腸癌腫瘤發生的關鍵因素,通過對2個微陣列數據集中分析ELN基因在結直腸患者腫瘤組織、鄰近非腫瘤結腸組織及健康對照組中的表達情況,結果發現,與癌旁非腫瘤組織和健康對照組相比,結直腸癌患者腫瘤中ELN基因表達增加,提示ELN在結直腸腫瘤發展和微環境中發揮著重要作用。亦有學者研究結果提示,ELN的表達與膀胱癌[16]、膠質瘤[17]患者的預后有關。

綜上所述,通過對乳腺癌腦轉移組織與乳腺癌組織之間的差異表達基因進行生物信息學分析,發現DCN、ELN 2個與乳腺癌腦轉移患者預后相關的核心基因,由于腫瘤位置特殊性,能選用的數據集及樣本量雖較少,但仍可為乳腺癌腦轉移的預后和治療提供一定方向。