miRNA-494-3p 靶基因預測及其相關信號通路的生物信息分析

王玉美 徐廣峰 張琳欣 鄭 君 楊 欣 張佩瀅 林小飛

微小RNA（microRNA, miRNA）是在真核生物中發現的一類內源性具有調控功能的非編碼RNA，在物種進化中相當保守，其通過與靶標mRNA 3'UTR區結合，以抑制翻譯或降解靶標mRNA，實現對基因表達的負調控作用。越來越多的研究已證實miRNA 的功能強大，它不但參與了多種生命活動，包括細胞內信號轉導、細胞增殖、分化、凋亡、代謝、心臟發育、腦發育等，而且在多數疾病的發生發展過程中也發揮著重要作用[1-9]。本課題組在前期研究中，采用μParaflo?微流體芯片技術檢測人脂肪組織miRNA 表達譜差異時，篩選出一條高表達于正常人脂肪組織、低表達于肥胖伴胰島素抵抗患者脂肪組織中的miR-494-3p。為進一步開展miR-494-3p 的靶基因鑒定和功能研究，本文采用生物信息學的方法對miR-494-3p 進行靶基因預測，并對預測的靶基因集合進行基因本體（geneontology, GO）和生物學通路的富集分析。

1 材料與方法

1.1 靶基因預測

應用miRNA 靶標基因數據庫StarBase（https://starbase.sysu.edu.cn/）進行靶基因預測，得到有關miRNA-494-3p 的靶基因總數。此靶基因數據庫集成了microT、miRanda、miRmap、PITA、RNA22、PicTar和TargetScan 共7 個傳統常用的miRNA 靶標預測工具。選取miRanda、PITA 和Targetscan 3 個數據庫預測結果的交集作為進一步分析的基因集合。

1.2 GO 分析

利用DAVID 數據庫（https://david.ncifcrf.gov/），應用GO 對靶基因進行功能富集分析，根據GO 注釋中的分子功能、生物學過程、細胞組分等應用選項，進行相應GO 注釋顯著性分析（P＜0.05）。

1.3 京都基因與基因組百科全書（KEGG）信號通路富集分析

應用DAVID 數據庫（https://david.ncifcrf.gov/），針對預測出的相關靶基因，進行KEGG 信號轉導通路富集分析，通過軟件附帶的Fisher Exact Test 計算P值，P＜0.05 代表具有統計學意義的信號轉導通路。

1.4 統計學分析

采用SPSS 26.0 統計軟件進行數據分析，GO分析及KEGG 信號通路富集分析中數據間差異比較采用ANOVA 檢驗，其中KEGG 中數據P 值采用Fisher's exact test 計算，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 靶基因預測結果

采用 miRNA 靶標基因數據庫 StarBase 中miRanda、PITA 和Targetscan 3 個數據庫對miRNA-494-3p 的靶基因進行預測，結果發現預測靶基因共有253 個。部分靶基因見表1。

表1 miRNA-494-3p經由StarBase預測所得的部分靶基因

2.2 GO 分析結果

利用DAVID 數據庫，對以上miRNA-494-3p 的253 個靶基因進行GO 功能富集分析，共得到24 條靶基因的分子功能注釋信息、47 條靶基因的生物學過程注釋信息及23 條靶基因的細胞組分注釋信息。隨后將以上基因分別投射至GO 的三大應用功能上，結果顯示，miRNA-494-3p 預測靶基因集合分別富集在蛋白質結合、雙鏈DNA 結合、RNA 結合等分子功能，RNA 聚合酶Ⅱ的轉錄調控、細胞增殖的正調控、細胞分化、細胞凋亡等生物學過程以及細胞核、核質、胞漿、細胞質、細胞隔膜等細胞組分上。見表2～4。

表2 miRNA-494-3p 預測靶基因GO 分析的分子功能分類（P＜0.01 列舉如下）

表3 miRNA-494-3p 預測靶基因GO 分析的生物學過程分類（P＜0.01 列舉如下）

表4 miRNA-494-3p 預測靶基因GO 分析的細胞組分分類（P＜0.01 列舉如下）

2.3 KEGG 信號通路富集分析結果

應用DAVID 數據庫，在GO 注釋分類的基礎上，針對預測出的253 個靶基因集合，進行KEGG 信號轉導通路富集分析。結果顯示，miRNA-494-3p 的靶基因功能主要富集于癌癥通路、FoxO 信號通路、細胞吞噬作用、刺猬信號通路、細胞黏附連接、肌動蛋白細胞骨架的調控、谷氨酸能突觸、晝夜節律以及p53 信號通路中（P＜0.05）。見圖1。

圖1 miRNA-494-3p 預測靶基因的KEGG 信號通路氣泡圖

3 討論

自從1993 年首次發現miRNA 以來，人們一直在積極研究miRNA 在病理和生理條件下的關鍵作用[10]。近年來，越來越多的研究證實，miRNA 功能涉及多種生物學過程，如細胞增殖、分化、代謝、胚胎發育、炎癥、衰老和程序性細胞死亡等[11-15]，miRNA的異常表達會導致多種人類疾病發生[16-20]。隨著miRNA 研究的日益深入，人們發現的miRNA 種類越來越多，每個miRNA 可能有多個靶基因，而幾個miRNA 也可以調節同一個基因。面對數目巨大的miRNA，如何開展其功能研究成為嚴峻挑戰。GO 分析及KEGG 信號通路富集分析等生物信息學分析方法的出現為miRNA 表達譜之后的相關研究（如靶基因的驗證、miRNA 的具體調控機制等）提供了有力證據。

本研究應用miRNA 靶標基因數據庫StarBase 進行靶基因預測，選取miRanda、PITA 和Targetscan 3個數據庫預測結果的交集（共253 個靶基因）作為進一步分析的基因集合。然后利用DAVID 數據庫，對253 個靶基因進行GO 分析和KEGG 信號通路富集分析，結果顯示，miRNA-494-3p 功能主要富集在蛋白質結合、雙鏈DNA 結合、RNA 結合等分子功能，RNA 聚合酶Ⅱ的轉錄調控、細胞增殖的正調控、細胞分化、細胞凋亡等生物學過程以及細胞核、核質、胞漿、細胞質、細胞隔膜等細胞組分上。miRNA-494-3p參與的生物學通路主要富集于癌癥通路、FoxO 信號通路、細胞吞噬作用、刺猬信號通路、細胞黏附連接、肌動蛋白細胞骨架的調控、谷氨酸能突觸、晝夜節律以及p53 信號通路中。國內外多項研究表明，miRNA-494-3p 參與多個生物學過程[21-22]及多種疾病的發生發展進程，主要包括癌癥[23-25]、心血管疾病[26-28]、肺部疾病[29]、腦損傷[30]、免疫系統功能改變[31]以及胰島素抵抗、2 型糖尿病[32]等，與本文對miRNA-494-3p 生物信息學分析的結論相吻合。Peng 等[21]的研究發現，在周圍神經損傷的Sprague-Dawley 大鼠中，miR-494-3p 表達水平降低，但Krüppel 樣因子7（KLF7）表達水平提升。敲除miR-494-3p 可促進細胞增殖，并抑制細胞凋亡，而過表達miR-494-3p 或沉默KLF7 則會導致相反的結果。實驗證實，miR-494-3p 通過負性調節KLF7 介導神經膜細胞的增殖和凋亡。一項有關鼻咽癌的研究[24]顯示，與非腫瘤鼻咽上皮組織或鼻咽細胞（NP69）相比，miR-494-3p 在鼻咽癌標本和鼻咽癌細胞系中普遍上調。進一步機制研究證實，miR-494-3p 通過與靶基因Sox7 非翻譯區的特定位點結合，在轉錄后水平對Sox7 進行負調控，促進鼻咽癌細胞的生長、遷移和侵襲。Zheng 等[27]的研究證實，BRD4 是miR-494-3p 的靶基因，通過上調miR-494-3p和抑制 BRD4，可以抑制組蛋白去乙酰化酶 3（HDAC3）的表達水平，在心肌缺血再灌注損傷（MI/RI）中發揮保護作用，這可能有助于MI/RI 的治療。吳潔等[32]對體外高糖高脂誘導的H9c2 細胞胰島素抵抗模型進行研究，結果發現miR-494-3p 通過下調胰島素受體底物-1（IRS1）促進糖尿病大鼠心肌細胞胰島素抵抗的形成。

綜上所述，miRNA-494-3p 的功能主要富集在與癌癥、胰島素抵抗、糖尿病、炎癥、胚胎發育等相關的多個信號通路中，為進一步研究其對靶基因和信號通路的調控作用及其可能的機制提供了線索。