經(jīng)斷調(diào)理丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

楊 東

經(jīng)斷調(diào)理丸處方是由名老中醫(yī)專家王光輝主任醫(yī)師根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)化裁而成，由牡丹皮、女貞子、墨旱蓮、生地黃、熟地黃等15 味中藥組成。經(jīng)斷調(diào)理丸具有滋腎潛陽(yáng)、清心平肝的功效，臨床常用于更年期綜合征兼腎陰虧虛、心肝火旺證的治療。女貞子、墨旱蓮均歸肝、腎經(jīng)，常配伍使用起補(bǔ)益肝腎的作用[1-2]。文獻(xiàn)[3-4]報(bào)道，女貞子和墨旱蓮配伍，可明顯影響更年期大鼠的激素和脂代謝水平，并能治療女性絕經(jīng)期骨質(zhì)疏松癥和激素缺乏導(dǎo)致的肥胖癥。生地黃味甘，性寒，熟地黃味甘，性微溫，兩者配伍用于肝血虧虛、腎陰不足證[5-6]。牡丹皮、合歡皮和丹參合用起清心平肝、解郁安神之功[7-9]。牡丹皮主要有效成分是丹皮酚，高效液相色譜法（HPLC）含量測(cè)定常作為含牡丹皮中成藥的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)[10]。為對(duì)經(jīng)斷調(diào)理丸的質(zhì)量進(jìn)行有效控制，本研究擬建立墨旱蓮、合歡皮的顯微鑒別，女貞子、丹參的薄層鑒別，以HPLC 測(cè)定牡丹皮的主要成分丹皮酚的含量為定量鑒別，以期建立可靠穩(wěn)定的經(jīng)斷調(diào)理丸質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

1 材料與儀器

1.1 藥品與試劑

女貞子對(duì)照藥材（批號(hào)：121041-201905）；齊墩果酸對(duì)照品（批號(hào)：110709-201808，含量：91.7%）；丹皮酚對(duì)照品（批號(hào)：110708-201908，含量：99.9%）；丹酚酸B 對(duì)照品（批號(hào)：111562-201917，含量：92.24%）；經(jīng)斷調(diào)理丸（本院自制，每包裝9 g，批號(hào)：211011、211012、211013）；色譜純甲醇，其他試劑選用分析純。

1.2 儀器

LC20A 型高效液相色譜儀、ATY124 型分析天平（島津科技有限公司）；IX53 型奧林巴斯顯微鏡（北京瑞科中儀科技有限公司）；HH 型電熱恒溫水浴鍋（江蘇中大儀器科技有限公司）；AB135-S 型分析天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；硅膠G板（煙臺(tái)市化學(xué)工業(yè)研究所）；HS3120 型超聲波提取器（天津恒奧科技發(fā)展有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 顯微鑒別

取經(jīng)斷調(diào)理丸適量，研成細(xì)粉，取少量涂勻載玻片，加水合氯醛1 滴，涂勻透化后置于顯微鏡下觀察。由圖1 可見(jiàn)，墨旱蓮多為3 細(xì)胞非腺毛，長(zhǎng)260～700 μm，其中基部細(xì)胞稍膨大，中部細(xì)胞較長(zhǎng)，壁厚，且有明顯突起呈疣狀，頂端細(xì)胞近三角形，形狀急尖而短。由圖2 可知，合歡皮的纖維細(xì)長(zhǎng)成束，直徑范圍在7～22 μm，草酸鈣方晶分散于周?chē)?xì)胞中并形成晶纖維，含晶細(xì)胞壁木化或微木化，增厚且不均勻。

圖1 墨旱蓮的顯微鑒別（非腺毛）

圖2 合歡皮的顯微鑒別（晶纖維）

2.2 薄層鑒別

2.2.1 女貞子的薄層鑒別 取適量的經(jīng)斷調(diào)理丸，研成細(xì)粉，取約10 g，置錐形瓶中，加甲醇20 ml，加熱回流30 min，濾過(guò)，濾液蒸干，用無(wú)水乙醇-三氯甲烷（3∶2）混合溶液1 ml 溶解殘?jiān)玫焦┰嚻啡芤骸Ｈ∨懽訉?duì)照藥材粉末1 g，按上法制成對(duì)照藥材溶液。按經(jīng)斷調(diào)理丸處方比例取缺女貞子的其他藥材，根據(jù)制備工藝制成去除女貞子的陰性對(duì)照品粉末，相同方法制備去除女貞子的陰性對(duì)照溶液。取適量齊墩果酸對(duì)照品，加甲醇溶解，得到濃度為1 mg/ml 的齊墩果酸對(duì)照品溶液。以上溶液各吸取5 μl，點(diǎn)樣于同一硅膠G 薄層板上，選擇環(huán)己烷-丙酮-乙酸乙酯（5∶2∶1）展開(kāi)劑，展開(kāi)至距薄層板上沿1.5 cm 處時(shí)取出晾干后，10%硫酸乙醇溶液顯色，置于105 ℃干燥箱中，至斑點(diǎn)清晰顯色。由圖3 可知，經(jīng)斷調(diào)理丸供試品薄層色譜中，女貞子對(duì)照藥材與齊墩果酸對(duì)照品有相同的顯色斑點(diǎn)，而缺女貞子陰性對(duì)照品無(wú)顯色斑點(diǎn)。

圖3 女貞子的薄層色譜

2.2.2 丹參的薄層鑒別 取經(jīng)斷調(diào)理丸適量，研成細(xì)粉，取約20 g，置錐形瓶中，加75%甲醇50 ml，超聲40 min，濾過(guò)，將濾液濃縮至1 ml，作為供試品溶液。按經(jīng)斷調(diào)理丸處方比例取缺丹參的其他藥材，根據(jù)制備工藝制得除丹參的陰性對(duì)照品，按上述方法制成陰性對(duì)照溶液。取丹酚酸B 對(duì)照品，溶于75%甲醇，制得2 mg/ml 的丹酚酸B 對(duì)照品溶液。吸取以上溶液各5 μl，點(diǎn)樣于同一硅膠G 薄層板上，選擇甲苯-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（2∶3∶4∶0.5∶2）為展開(kāi)劑，展開(kāi)至距薄層板上沿1.5 cm 處取出，于陰涼處晾干，在254 nm 波長(zhǎng)紫外光下檢視。由圖4 可知，在薄層色譜板的相應(yīng)位置上，經(jīng)斷調(diào)理丸供試品與丹酚酸B 對(duì)照品有相同的顯色斑點(diǎn)，而陰性對(duì)照品無(wú)顯色斑點(diǎn)[11]。

圖4 丹參的薄層色譜

2.3 丹皮酚含量測(cè)定

2.3.1 對(duì)照品溶液的制備 取適量的丹皮酚對(duì)照品，精密稱定，甲醇溶解制備丹皮酚對(duì)照品溶液，濃度為0.124 8 mg/ml。精密量取5 ml，置于25 ml容量瓶中，加甲醇溶解至刻度，即得丹皮酚對(duì)照品溶液[12]，濃度為24.96 μg/ml。

2.3.2 供試品溶液的制備 取經(jīng)斷調(diào)理丸適量，研細(xì)，精密稱定1.0 g，置于具塞錐形瓶中，精密量取25 ml 甲醇，密塞稱重，超聲提取（250 W，50 kHz）30 min，擦干錐形瓶放冷，甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，濾過(guò)，即得供試品溶液。

2.3.3 陰性對(duì)照溶液的制備 制備不含牡丹皮的經(jīng)斷調(diào)理丸其他藥材粉末，精密稱定1.0 g，置于具塞錐形瓶中，精密量取25 ml 甲醇，密塞稱重，超聲提取（250 W，50 kHz）30 min，擦干錐形瓶放冷，甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，濾過(guò)，即得。

2.3.4 色譜條件 色譜柱為Agilent TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；甲醇-水（38∶62）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)：274 nm；柱溫：30 ℃；流速：1.0 ml/min。

2.3.5 專屬性考察 分別取供試品溶液、對(duì)照品溶液和陰性對(duì)照溶液，在2.3.4 項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖。在“2.3.4”項(xiàng)下色譜條件，由圖5～7 可知：在相同的保留時(shí)間位置上供試品溶液與丹皮酚對(duì)照品溶液有相應(yīng)的色譜峰，而陰性對(duì)照溶液色譜中則無(wú)此色譜峰，說(shuō)明經(jīng)斷調(diào)理丸處方中其他藥味成分對(duì)丹皮酚的測(cè)定結(jié)果無(wú)干擾。

圖5 供試品溶液的HPLC 色譜

圖6 丹皮酚對(duì)照品溶液的HPLC 色譜

圖7 陰性對(duì)照溶液的HPLC 色譜

2.3.6 線性關(guān)系的考察 精密吸取1.0、2.5、5.0、10.0、15.0 ml 對(duì)照品貯備溶液，均用甲醇稀釋定容至25 ml，分別得到4.99、12.48、24.96、49.92、74.88 μg/ml的對(duì)照品溶液。在“2.3.4”項(xiàng)下色譜條件，分別進(jìn)樣，記錄峰面積[13]。縱坐標(biāo)為丹皮酚對(duì)照品的峰面積（y），橫坐標(biāo)為質(zhì)量濃度（x），以此進(jìn)行回歸分析，得回歸方程y=54 028x+256.6，r=0.999 9。表明在4.992～74.88 μg/ml 范圍內(nèi)丹皮酚含量與峰面積具有良好的線性關(guān)系。

2.3.7 精密度試驗(yàn) 在“2.3.4”項(xiàng)下色譜條件，對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄峰面積[14]。計(jì)算得丹皮酚的峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.3%（n=6）。表明本實(shí)驗(yàn)所用儀器具有良好的精密度。

2.3.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 供試品溶液室溫下分別于3、4、5、6、7、8 h 取樣，按照“2.3.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積[14]。計(jì)算得丹皮酚的峰面積RSD為0.4%（n=6），可知在室溫下供試品溶液放置8 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.3.9 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取6 份經(jīng)斷調(diào)理丸（批號(hào)211011）各1.0 g，按照“2.3.2”項(xiàng)制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算丹皮酚的含量[14]。結(jié)果顯示，丹皮酚的平均含量為0.53 mg/ml，RSD 為1.6%（n=6），表明方法具有良好的重復(fù)性。

2.3.10 加樣回收率試驗(yàn) 取經(jīng)斷調(diào)理丸（批號(hào)211011）適量，粉碎，稱取6 份，每份精密稱定0.5 g，分別置于具塞錐形瓶，加入濃度為0.124 8 mg/ml 丹皮酚對(duì)照品貯備溶液2 ml，加入甲醇23 ml，密塞稱重，超聲處理（300 W，50 kHz）30 min，放冷，甲醇補(bǔ)足失重，搖勻?yàn)V過(guò)，得到供試品溶液。按照“2.3.4”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜峰的峰面積并計(jì)算加樣回收率[15]。回收率均在試驗(yàn)要求范圍內(nèi)，說(shuō)明分析方法能夠準(zhǔn)確測(cè)量樣品中的目標(biāo)成分，并且樣品處理過(guò)程中沒(méi)有明顯的損失。RSD 為0.2%，符合要求。見(jiàn)表1。

表1 6 份加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.3.11 含量測(cè)定 適量取3 個(gè)批次經(jīng)斷調(diào)理丸，分別按照“2.3.2”項(xiàng)制備供試品溶液，按照“2.3.4”項(xiàng)進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜峰的峰面積并計(jì)算丹皮酚的含量，復(fù)測(cè)2 次，得到平均值。見(jiàn)表2。

表2 經(jīng)斷調(diào)理丸中丹皮酚含量測(cè)定結(jié)果(n=2,mg/g)

3 討論

本院經(jīng)斷調(diào)理丸的工藝是原藥材全粉入藥的加工形式。墨旱蓮、合歡皮粉末顯微特征明顯，無(wú)干擾，因此，將墨旱蓮、合歡皮顯微鑒別作為質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)之一。女貞子、丹參的薄層定性鑒別實(shí)驗(yàn)，在薄層色譜板的相應(yīng)位置上，供試品與對(duì)照品有相同的顯色斑點(diǎn)，而陰性對(duì)照品無(wú)相應(yīng)顯色斑點(diǎn)，表明陰性對(duì)照品無(wú)干擾[16-17]。丹皮酚HPLC 分離效果好，除含牡丹皮外處方中的其他藥味無(wú)干擾；丹皮酚含量測(cè)定在4.99～74.88 μg/ml 范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系；供試品溶液在8 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好，加樣回收率較好，丹皮酚HPLC含量測(cè)定可列入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)方法具有成分明確、方法可行、重復(fù)性較好的特點(diǎn)，能夠用于檢測(cè)經(jīng)斷調(diào)理丸的有效指標(biāo)，有利于經(jīng)斷調(diào)理丸的質(zhì)量保證和療效發(fā)揮，提高治療學(xué)意義，保障患者用藥安全。