基于網絡藥理學與分子對接分析都梁丸抗偏頭痛的作用機制

王 靜 朱春璐 袁子民*

都梁丸收載于2020 版《中華人民共和國藥典》一部[1]，由白芷（酒燉）和川芎組成，具有祛風散寒、活血通絡功效，臨床用于風寒瘀血阻滯脈絡所致的頭痛，但其作用機制尚未完全闡明。本研究結合前期研究確定的都梁丸入血成分，利用網絡藥理學與分子對接技術，通過基因本體（GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路注釋分析等生物學信息手段對靶點及通路進行分析，深入研究都梁丸的效應物質、質量標志物（Q-Marker），探討都梁丸抗偏頭痛的作用機制，為都梁丸的臨床應用、藥效物質基礎與作用機制的深入研究提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 主要數據庫和軟件

主要數據庫和軟件見表1。

表1 主要數據庫和軟件

1.2 化合物信息

本研究前期血清藥物化學研究結果表明，都梁丸中有12 種活性成分入血，可能為其主要的藥效物質基礎，即花椒毒酚、水合氧化前胡素、白當歸素、氧化前胡素、白當歸腦、佛手柑內酯、歐前胡素、異歐前胡素、阿魏酸、洋川芎內酯Ⅰ、洋川芎內酯A、藁本內酯，其中白芷有8 個，川芎有4 個[2]。通過TCMSP 數據庫檢索12 個化合物的結構、成分編號（MOL.ID）、分子式信息。見表2。

表2 都梁丸入血的化學成分

1.3 化合物潛在靶點的反向預測

采用ChemBioDraw Ultra 14.0 中Structure 選項下的“Covert Name to Structure”的功能繪制出12 個化合物的2D 結構，并以MDL SDfile（*.sdf）格式保存。再打開Chem3D 軟件，將12 個化合物的2D結構轉換為3D 結構，并以SYBYL2（*.mol2）格式保存后，上傳到PharmMapper Serve 服務器進行靶標反向預測，以活性小分子為探針，搜尋潛在靶點，預測其生物活性。結果按Fit score 由高到低排序，選取每個化合物的前25 個靶標作為備選靶標。

1.4 潛在靶點的篩選

在DrugBank數據庫檢索美國食品藥品監督管理局（FDA）批準“antimigraine”的小分子藥物。在GeneCards 和NCBI 數據庫檢索與偏頭痛相關的疾病靶點。對獲得的備選靶標與疾病靶點進行對比分析，歸納總結抗偏頭痛作用的潛在靶點。

1.5 蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡的構建

將22 個潛在靶點導入String 數據庫中，對象限定為人，設定combine score＞0.7，獲取PPI 信息。將獲得的PPI 信息導入Cytoscape 3.6.0 軟件中繪制PPI 網絡圖。

1.6 基因本體（GO）富集分析和KEGG 通路注釋分析

用Rv 3.5.1 軟件對潛在靶點進行GO 富集分析和KEGG 通路注釋分析。GO 富集分析包括生物過程、分子功能和細胞組分3 個分支，并運用GrapHPad Prism 軟件繪制出3 個模塊的條形圖。

1.7 活性成分-潛在靶點-通路網絡圖的構建

將活性成分、潛在靶點和通路導入Cytoscape 3.6.0軟件中，構建活性成分-潛在靶點-通路的網絡圖。

1.8 分子對接驗證

選取PPI Degree 排名前8 的靶點與都梁丸中的12 個活性成分進行分子對接驗證，用ChemBioDraw Ultra 軟件繪制活性成分的3D 圖，利用PharmMapper數據庫得到靶點的蛋白質結構數據庫編號（PDB ID）后，用Systems dock Web Site 進行分子對接[3]。

2 結果

2.1 潛在靶點預測

采用PharmMapper 數據庫得到備選靶標，將備選靶標與DrugBank、GeneCards、NCBI 數據庫檢索的疾病靶點對比分析，歸納總結22 個靶點作為抗偏頭痛的潛在靶點，具體結果見表3。都梁丸中12 個活性成分對應的潛在靶點數見表4，都梁丸中潛在靶點數量排名前5 的活性成分有3 個是白芷的成分，2 個是川芎的成分。

表3 活性成分潛在靶點信息

表4 都梁丸中活性成分靶點數目

2.2 潛在靶點PPI 網絡構建與分析

將上述20 個潛在靶點（MAPK10、BRAF 與其他蛋白沒有相互作用）相互作用網絡圖信息導入Cytoscape 軟件中，共有20 個節點、38 條邊。節點表示蛋白，邊表示蛋白相互作用。在Cytoscape 的generate style from statistics 工具中獲得度值和靶點。見表5。

表5 都梁丸相互作用蛋白重要靶點及度值

2.3 GO 富集分析及KEGG 通路注釋分析

從都梁丸中預測出的22 個潛在靶點導入Rv 3.5.1軟件中進行GO 富集分析和KEGG 通路注釋分析。得到影響顯著的通路（P＜0.05）有46 條，與抗偏頭痛作用相關的主要通路有3 條：hsa04614（Reninangiotensin system）、hsa04010（MAPK signaling pathway）、hsa04931（Insulin resistance）。GO 富集分析結果顯示，在生物過程中這些靶點主要涉及激素代謝過程、對類固醇激素的反應、腺體發育過程；在分子功能中主要涉及激素結合、類固醇結合、內肽酶活性等方面；在細胞組分中主要涉及質膜外側、膜筏、膜微區、膜區、細胞質囊泡腔、囊泡腔、受體復合物等方面。

2.4 活性成分-潛在靶點-通路網絡模型構建

構建“成分-潛在靶點-通路”的模型中有80 個節點和190 條邊，淺灰色代表預測靶點，灰色代表活性成分，深灰色代表通路，邊表示三者之間的相互作用，結果如圖1。都梁丸中有12 個活性成分作用于不同靶點，靶點分布于不同通路，相互協調、共同調節都梁丸抗偏頭痛的作用，符合中藥復方“多成分-多靶點-多途徑”的作用特點。

圖1 都梁丸活性成分-靶點-通路網絡

2.5 分子對接

對PPI 網絡中Degree 排名前8 的重要靶點（表5）進行分子對接驗證，用GrapHPad Prism 繪制分子對接結果熱圖，docking score 在4.25～5 為深灰色，docking score 在5～7 為白色，docking score＞7 為黑色，結果見圖2。以對接得分最大的佛手柑內酯為例，將其與靶標（AR、ESR1）進行分子對接，結果見圖3～4。一般認為docking score＞4.25 具有生物活性，本研究對接結果中docking score＞4.25 占76%，表明12 個活性成分與8 個重要靶點有較好的結合活性。

圖2 12 個活性成分對接得分結果熱圖

圖3 與AR 靶標分子對接

圖4 與ESR1 靶標分子對接

3 討論

都梁丸中白芷為君藥，體現了白芷在都梁丸中的重要性；川芎為臣藥，其配伍原理是引藥上行，上達頭目。根據傳統中醫藥理論，都梁丸的多成分多靶點的作用機制，符合中藥復方的特點。本研究通過前期血清藥物化學研究結果確定了都梁丸中可能潛在的藥效物質基礎的活性成分，本研究采用網絡藥理學和分子對接技術發現都梁丸的活性成分主要通過調控MME、腎素-血管緊張素系統、激素受體途徑發揮抗偏頭痛作用。在活性成分與潛在靶點的PPI 研究中，經網絡分析后發現血管緊張素轉換酶（ACE）、ESR1、AR、SHBG、MME 等主要靶點可能與偏頭痛發生密切相關。ACE 是RAS 中的關鍵酶，可使血管緊張素Ⅰ轉化為血管緊張素Ⅱ，血管緊張素轉化酶抑制劑（ACEI）類藥物在預防偏頭痛中起著重要作用。ACEI 是一種緩激肽的抑制劑，緩激肽可以產生P 物質（SP），SP 是中樞神經系統的致痛物質[4-6]；SP 和降鈣素基因相關肽（CGRP）共同調節三叉神經纖維的敏感性，而三叉神經的活化可導致神經肽的釋放，CGRP 可增強SP 的作用，原因為CGRP 可抑制SP 降解酶活性，文獻[4,7]報道SP與CGRP 間存在微弱的相關性，發作期間偏頭痛組SP、CGRP 水平明顯高于對照組，ACE 活性與SP 水平成正比，ACE 活性與CGRP 水平之間未發現相關性。RAS 系統可以干擾一氧化氮（NO）的生物利用度并促進氧化應激，NO 產生增加，血管緊張素Ⅱ通過血管緊張素Ⅱ受體激活NF-κB 中的神經激肽，使一氧化氮合酶（NOS）的表達增加[6,8]。偏頭痛發作時血漿中的NO 水平升高，NOS 參與內源性NO 的合成，所以NOS 水平也升高。本研究發現都梁丸可能作用于ACE 進一步降低CGRP、SP、NO 水平，抑制NOS 活性，進一步降低神經源性炎癥反應發揮抗偏頭痛作用[9]。

現代研究表明偏頭痛發病與性激素受體途徑存在一定關系，目前有8 個基因被研究，即：ESR1、ESR2、PGR、AR、FSHR、NRIP1、CYP19A1、MTHFR[10]。CYP19A1 是雌激素產生的關鍵酶，CYP19A1 基因遺傳變異與循環激素水平有關，循環激素水平可能取決于性激素結合球蛋白（SHBG）水平[11]。有研究表明，在美國和西歐終生患有偏頭痛的女性約為43%，男性約為18%。女性患有月經性偏頭痛或月經相關性偏頭痛與雌激素水平存在一定關系[12-13]，近年來雌激素代替治療可緩解偏頭痛得到廣泛的認可，有研究證實雌激素水平與偏頭痛發生負相關，雌激素水平升高可減少發病次數[14]。雌激素受體基因的遺傳變異也是導致偏頭痛發病的重要環節，有研究表明編碼性激素受體途徑中蛋白質的基因變異與偏頭痛之間存在一定關系[13]。本研究發現都梁丸可能具有調節激素受體作用，改變激素水平，可為都梁丸用于激素引起的偏頭痛的治療提供科學依據。

MME 基因又稱腦啡肽酶（NEP）基因，主要影響β-淀粉樣蛋白（Aβ）代謝通路，是一種切割大量底物的金屬肽酶及參與腦內Aβ 降解代謝的限速酶，在阿爾茨海默病（AD）發病機制中起保護作用[15]。其表達下調可加劇Aβ 聚集，上調其表達能降低腦內Aβ 水平。Aβ 可不可逆抑制毛細血管內皮細胞Na+-K+-ATP 酶活性，導致腦脊液中Na+濃度降低，從緩解偏頭痛的發生[16]。都梁丸可能通過抑制NEP 酶活性，減緩Aβ 聚集，抑制毛細血管內皮細胞Na+-K+-ATP酶的過度活躍，阻止皮質擴散性抑制（CSD）發生，從而預防偏頭痛發作[17-18]。

GO 富集分析結果表明潛在靶點在激素結合、類固醇結合、內肽酶活性功能參與最多，在脂膜外側、膜筏、膜微區、膜區、細胞質囊泡腔、囊泡腔、受體復合物分布最廣，并主要參與激素代謝過程、對類固醇激素反應等生物過程。

在KEGG 通路分析中發現，都梁丸可能通過胰島素抵抗、MAPK 信號通路、調節腎素-血管緊張素系統等發揮抗偏頭痛作用。現代研究表明慢性偏頭痛發生與胰島素抵抗具有相關性，主要與下丘腦神經肽Y（NPY）分泌增加引起胰島素敏感性受損，出現胰島素抵抗有關[19]。MAPK 活化主要通過逐級磷酸化發揮信號傳導的生物功能，信號通路ERK1/2和P38 以磷酸化形式被激活，通過調控靶蛋白轉導來參與炎癥和疼痛等反應。神經源性炎癥期間釋放炎癥因子可激活MAPK 信號轉導級聯途徑，引起偏頭痛發作[20]。另外有研究表明白芷-川芎藥對中的活性成分主要通過調節5-羥色胺（5-HT）和能量代謝通路治療偏頭痛[21]。但本研究的KEGG 通路分析結果與其不同，可能與活性成分的選擇、數據庫及使用軟件等不同有關。

分子對接結果分析，docking score＞7 表明蛋白與化合物有強烈的結合性，本研究發現花椒毒酚與AR、ESR1 的docking score 分別為7.983、7.971，佛手柑內酯與AR、ESR1 的docking score 分別為8.059、8.137，說明激素受體在治療偏頭痛方面有重要的作用，但有關ESR1 報道較多，AR 較少，可進一步深入研究AR 在抗偏頭痛中的作用機制。本研究發現docking score＞7 的成分主要來源于白芷，未有川芎中的成分，兩者均為入血成分，可能是治療偏頭痛主要的藥效物質基礎，體現了都梁丸中以白芷辛溫發散、祛寒止痛為君藥，川芎活血行氣、引藥上行為臣藥的配伍理論。