腦脊液腫瘤細胞整合素β1 檢測在肺癌腦膜轉移診斷中的應用價值

陳紅巖 陳英 陳梅根 李華

肺癌目前仍然是發病率、死亡率最高的惡性腫瘤, 隨著肺癌發生逐年增加, 肺癌腦膜轉移患者近年呈現明顯增高趨勢［1］。據文獻報道［2］約有15%肺癌患者會出現腦膜轉移。腦膜轉移癌又稱為腦膜癌病變,多是由于原發癌灶中的腫瘤細胞在腦膜、脊髓蛛網膜下間隙局灶性浸潤或彌漫性擴散而致病。有數據顯示［3,4］, 肺癌繼發腦膜轉移患者若不接受治療, 其中位生存時間只有4～6 周, 若接受綜合治療生存期可能會延遲到3～5 個月, 最長達3 年以上。早診斷、早干預對本病預后改善有積極的作用。在臨床上診斷腦膜轉移的方法主要有磁共振成像(MRI)增強掃描、腦脊液細胞學檢測, 其中腦脊液細胞學檢測為診斷的“金標準”［5］。近年有研究報道顯示［6］, 造成肺癌腦膜轉移的因素較多, 如機體的免疫功能、血腦屏障損傷等,其中與腫瘤細胞整合素活性度有極大的關系。整合素β1是介導細胞與細胞外基質粘附的重要分子, 可影響腫瘤細胞增殖分化與遷移、侵襲［7］。目前已有研究指出［8］, 整合素β1可促使腦神經膠質瘤細胞在細胞外基質中粘附、遷移、侵襲, 但其在肺癌腦膜轉移中的表達及其診斷價值相關研究較少見。為深入探討肺癌腦膜轉移腫瘤細胞整合素β1活性程度及其臨床應用價值, 現將近2 年來肺癌腦膜轉移患者30 例與腦部非腫瘤疾病患者30 例進行腰穿腦脊液癌細胞整合素β1活性程度檢測, 結果分析報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2020 年1 月～2022 年12 月福建省市三級醫院神經內科、外科、腫瘤科、呼吸內科及重癥監護室(ICU)等臨床確診為“肺癌”且經多周期化療、放療及綜合治療的住院患者并經腦脊液細胞學檢測確診為肺癌腦膜轉移患者30 例設為病例組, 其中男14 例, 女16 例；年齡35～84 歲, 平均年齡(56.17±13.62)歲。納入標準：①顱腦MRI 掃描顯示轉移癌灶；②近6 個月內無顱腦損傷病史或腦炎病史, 且無顱腦手術史；③經脫水等治療后顱內高壓癥狀改善, 但改善不明顯；④無腦脊髓膜疾病。確診方法：11 例經肺癌根治術后病理組織檢查確診, 19 例經微創穿刺活檢病理檢查確診；基因檢測：除3 例未檢出基因突變點, 其余27 例均發現基因突變點, 突變點多為表皮生長因子受體(EGFR)21 外顯子L858R 突變, 其中3 例在EGFR 19 突變, 2 例P53 突變；從原發腫瘤發現到腦膜轉移時間2 個月～5 年, 平均時間(11.02±2.33)個月。另選取同期30 例腦部非腫瘤性疾病患者設為對照組, 其中男15 例, 女15 例；年齡30～80 歲, 平均年齡(55.36±13.10)歲。納入標準：①均為交通性腦積水；②住院治療期間需要經腰椎穿刺、腦室外引流、腰大池引流等收集腦脊液樣本行腦脊液檢查。兩組性別、年齡等一般資料對比差異無統計學意義(P>0.05), 具有可比性。

1.2 方法 腫瘤細胞整合素β1免疫組化染色 ：采用細胞玻片離心法收集兩組患者的腦脊液腫瘤細胞, 加腦脊液量2.5 ml, 若為腦室引流液量較多時, 先用物理方法濃縮10 倍, 再進行細胞收集, 標本應為當天的引流液。細胞收集后玻片置37℃溫箱60 min, 并采用免疫組化PV 系列二步法, DAB 顯色。試劑：①整合素β1抗體(Anti-Integrin beta 1 抗體)由英國ABCAM 公司提供；②DAB 顯色試劑盒購于福州邁新生物技術開發有限公司；③通用型二步法試劑盒購于北京中杉金橋生物技術有限公司分公司。

1.3 觀察指標及判定標準 ①分析病例組腦脊液腫瘤細胞整合素β1表達情況。②比較兩組腦脊液的腫瘤細胞整合素β1陽性表達情況, 腫瘤細胞整合素β1陽性判定：整合素β1免疫組化染色DAB 顯色后為棕黃色帶或棕黃色顆粒, 分布于腫瘤細胞膜及細胞漿。隨機計數100 個腫瘤細胞, 根據著色度和數量判斷陽性細胞所占百分比。陽性程度分級：陰性(-)：陽性細胞≤4%；陽性(+)：陽性細胞5%～10%；陽性(++)：陽性細胞11%～50%；陽性(+++)：陽性細胞≥50%。陽性細胞所占比例≤10%為活性低表達, 陽性細胞≥11%為活性高表達［9,10］。③分析腦脊液腫瘤細胞整合素β1活性高表達對肺癌腦膜轉移的診斷效能, 包括靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值。

1.4 統計學方法 應用SPSS26.0 統計學軟件對研究數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差( x-±s)表示, 采用t 檢驗；計數資料以率(%)表示, 采用χ2檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 病例組腦脊液腫瘤細胞整合素β1表達情況分析肺癌腦膜轉移腦脊液腫瘤細胞整合素β1活性主要呈高表達, 在胞膜及胞漿呈現明顯的棕黃色帶或棕黃色顆粒。見圖1, 圖2。其他細胞如激活型單核細胞、淋巴細胞等則不顯色或顏色很淡。見圖3, 圖4。

圖1 腫瘤細胞膜整合素β1 表達陽性(免疫組化染色×1000)

圖2 腫瘤細胞漿整合素β1 表達陽性(免疫組化染色×1000)

圖3 激活型單核細胞整合素β1 表達陽性(免疫組化染色×1000)

圖4 淋巴細胞整合素β1 表達陽性(免疫組化染色×1000)

2.2 兩組腦脊液腫瘤細胞整合素β1表達情況比較病例組整合素β1活性高表達率為80.00%, 顯著高于對照組的3.33%, 差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組腦脊液腫瘤細胞整合素β1 表達情況比較［n(%)］

2.3 腦脊液腫瘤細胞整合素β1高表達對肺癌腦膜轉移的診斷效能分析 腦脊液腫瘤細胞整合素β1活性高表達診斷肺癌腦膜轉移的靈敏度為80.00%(24/30),特異度為96.67%(29/30), 準確率為88.33%(53/60), 陽性預測值為96.00%(24/25), 陰性預測值為82.86%(29/35)。

3 討論

肺癌腦膜轉移病情進展較迅速, 患者預后極差,早期診療能夠延緩病情進展, 在一定程度上延長患者的生存期。當前臨床診斷肺癌腦膜轉移標準［11］：①有肺癌病史；②新出現神經系統相關癥狀體征；③顱腦MRI 顯示顱腦內癌灶征象；④腦脊液細胞學檢測顯示存在循環肺癌惡性腫瘤細胞。在符合①、②的基礎上具有③和④中任一項即確診。但在臨床實際中90%以上腦膜轉移患者的神經癥狀體征不明顯, 顱腦MRI 診斷特異度雖可達到100%, 但其假陰性率較高,可達到65%［12］。據文獻報道［13］腦脊液循環腫瘤細胞首次檢測陽性率只有55%, 二次檢測陽性率可升高至80%, ≥3 次檢測并不會增加陽性率, 可見上述目前各種檢測手段均存有優缺點, 仍需探索靈敏度、特異度更為良好的肺癌腦膜轉移診斷方法。癌癥最基本、最重要的病理特點是癌細胞侵襲、轉移［14］。在臨床上,腫瘤復發或癌灶轉移是肺癌患者死亡的主要原因。國內外研究表明［15,16］, 腫瘤侵襲及其遠處臟器轉移是多因素共同參與的過程, 其中細胞粘附是腫瘤轉移的關鍵環節, 而細胞外基質、細胞粘附因子在其中起著重要的作用。整合素家族、鈣粘素家族、免疫球蛋白家族、選擇素家族等均是目前最常見的可參與細胞與細胞之間、細胞與細胞外基質之間粘附效應的細胞表面粘附分子, 其中整合素在腫瘤侵襲、轉移過程中的作用備受關注。

3.1 整合素活性程度升高參與腫瘤侵襲、轉移過程整合素作為細胞表面粘附分子家族中的重要一員, 屬于跨膜受體蛋白的一種, 其廣泛存在于細胞表面, 通常由一個α 鍵和β 鍵非共價聯接形成跨膜異二聚體糖蛋白, 配體多是多種細胞外基質成分。整合素的生理功能主要通過與配體細胞外基質相結合, 介導細胞與細胞外基質粘附, 促使腫瘤細胞與細胞外基質的細胞內外雙向信號傳導, 誘發癌細胞增殖分化、遷移侵襲等病理活動［17］。據臨床研究表明［18,19］, 當腫瘤細胞進入血液循環, 整合素活性度明顯增高, 這有利于瘤細胞粘附于血管內皮, 使癌細胞隨血流轉移。

截至當前, 學者在哺乳動物體內發現了18 種α亞型和8 種β 亞型整合素［20］, 大量研究發現, 整合素β1在多種癌癥轉移中發揮著作用, 如肺癌［21］、乳腺癌［22］、胃癌［23］等。魏哲威等［24］研究顯示, 胃癌細胞中整合素β1呈高表達, 并參與胃癌細胞遷移。整合素β1與其相應配體結合后可促使粘著斑激酶激活,形成粘著斑, 并可促使腫瘤新生血管形成, 促使癌細胞向周圍正常組織侵襲, 進而參與腫瘤遷移、遠處臟器轉移瘤形成。本研究證實, 肺癌腦膜轉移患者整合素β1活性度較腦部非腫瘤患者明顯增高, 且肺癌腦膜轉移患者腦脊液中80%癌細胞整合素β1活性度為(++)與(+++), 提示肺癌細胞從原發癌灶中脫落粘附于鄰近組織臟器, 進而對遠處臟器轉移有促進作用。臨床上肺癌一旦出現腦膜轉移, 在中樞神經系統會出現明顯的陽性體征, 如頭痛、惡心、嘔吐或認知功能障礙等。腦脊液檢查也會出現明顯異常, 如葡萄糖降低、總蛋白質增高、腫瘤細胞明顯增多等。細胞學分析瘤細胞胞體巨大, 是小淋巴細胞5～10 倍以上, 核分裂相增多、核染色質粗、核內有明顯的核仁、胞漿嗜堿性, 并含有空泡［25］, 這些都與癌細胞整合素活性程度高有明顯相關性。

3.2 腦脊液腫瘤細胞整合素β1活性檢測診斷肺癌腦膜轉移臨床效能較高 本研究采用細胞玻片離心法收集腰穿腦脊液中的腫瘤細胞, 由于第二代細胞玻片離心儀［26］收集管容量大且密封性能好, 離心后細胞流失極少, 極大提高腦脊液中腫瘤細胞收集效果。經免疫組化染色后, 根據陽性分級程度［27,28］, 本組陽性細胞平均為43.2%, 最高為84%, 且本研究還發現腦脊液腫瘤細胞整合素β1活性高表達診斷肺癌腦膜轉移的靈敏度為80.00%, 特異度為96.67%, 準確率為88.33%, 陽性預測值為96.00%, 陰性預測值為82.86%, 提示腦脊液腫瘤細胞整合素β1活性檢測診斷特異度高, 這可能是腦脊液中癌細胞數量多, 也明顯提高腫瘤細胞收集與組化染色效果, 但其靈敏度相對稍低, 30 例患者中仍有3 例腦脊液腫瘤細胞整合素β1表達為陰性, 這可能是由于腦膜轉移處于發展初期, 癌細胞數量較少, 故其陽性細胞低于4%, 整合素呈低活性度。

癌性腦膜炎癌細胞整合素β1活性度增高, 有利于癌細胞的侵襲、生長, 同時也加劇病情的惡化, 特別在病情進展時, 化療、靶藥仍無法控制癌細胞擴散情況下, 通過應用整合素靶向藥物調控整合素的活性程度將有效控制病情發展［26-29］。時刻監測腦脊液腫瘤細胞整合素β1活性對肺癌腦膜轉移病情的發展或復發起重要作用。

綜上所述, 肺癌腦膜轉移患者腦脊液中腫瘤細胞整合素β1活性度明顯增高, 故檢測腦脊液中腫瘤細胞整合素β1活性度有助于提高本病鑒別診斷能力。