六種柚果不同部位礦物質元素、總酚、柚皮苷含量測定及抗氧化活性研究

張聲源,陳煒鈴,王楠,古秋明,況偉,3,陳嘉樂,蘇文欣,劉志偉*

1(嘉應學院,廣東省山區特色農業資源保護與精準利用重點實驗室,廣東 梅州,514015)2(梅州市南方金柚研究院,廣東 梅州,518000)3(嘉應學院廣東省柚類工程技術開發中心,廣東 梅州,514031)

柚為蕓香科(Rutaceae)柑橘屬(Citrus)植物柚[Citrusmaxima(Burm.) Merr.cv]的果實,性寒,具有行氣、除痰、止痛等功效[1]。研究表明,柚子富含多種營養成分和生理活性成分,具有抗氧化、抗癌、降血糖等藥理活性,具有很高的食用和藥用價值[2-5]。

廣東省梅州市是我國柚子主產區之一,已成功創建了以梅州柚為主導產業的1個國家級、3個省級現代農業產業園和1個國家級產業集群,全市種植面積達到了約41 333 hm2,年產量93萬t,占廣東全省的90%,占全國的20%,全球的10%[6]。目前規模化種植的品種有沙田柚(商品名為金柚)、蜜柚(白肉蜜柚、紅肉蜜柚、三紅蜜柚、黃肉蜜柚)、四季柚,同時梅州金柚、大埔蜜柚分別于2006年、2015年獲得了國家農產品地理標志,且2016年梅縣金柚獲得了國家地理標志證明商標,大埔蜜柚入選“中歐 100+100”地理標志互認互保產品[7]。

梅州產柚果品種多、品質獨特,柚果精深加工方面也在有序推進,已有柚花茶、蜜柚啤酒、果脯蜜餞等產品上市,具有廣闊的開發前景[8]。目前針對梅州地區柚類資源的研究多集中于栽培技術、活性物質提取工藝等方面[9-11],而不同品種柚果的不同部位在成分含量及抗氧化活性的比較研究未見報道。柚含有酚類、黃酮類、精油、果膠等活性成分,其中酚類因分子結構中含有酚羥基,易氧化,是柚類發揮抗氧化效果的物質結構基礎。而柚皮苷是主要的單酚類物質,含量顯著高于野漆樹苷、香草酸、甲基橙皮苷、新西蘭牡荊苷和阿魏酸等單酚類物質;此外,柚皮苷片制劑已進入了Ⅰ期臨床試驗,在食品醫藥領域應用潛力大,為此,實驗選取了酚類和柚皮苷含量及抗氧化活性作為評價指標,探究梅州產6種主栽柚子(沙田柚、四季柚、白肉蜜柚、黃肉蜜柚、三紅蜜柚、紅肉蜜柚)成熟果實4個部位(外皮層、中皮層、囊衣、汁胞)的總酚、柚皮苷含量與抗氧化活性的相關性及其礦物質元素含量差異,以期為梅州產柚果的深度開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試柚子于2021年9～12月采于廣東省梅州市梅縣區柚子種植基地,經嘉應學院醫學院聶華副教授鑒定為蕓香科(Rutaceae)柑橘屬(Citrus)植物沙田柚[Citrusmaxima(Burm.) Merr.cv.Shatian yu]、四季柚[Citrusgrandis(Linn)Osbeckl.cv.Siji yu]、紅肉蜜柚[Citrusmaxima(Burm.) Merr.cv.Hongroumi yu]、白肉蜜柚[Citrusmaxima(Burm.) Merr.cv.Bairoumi yu]、三紅蜜柚[Citrusmaxima(Burm.) Merr.cv.Sanhongmi yu]、黃肉蜜柚[Citrusmaxima(Burm.) Merr.cv.Huangroumi yu]。

沒食子酸標準品、福林酚試劑,上海麥克林生化科技有限公司;DPPH、ABTS,美國Sigma公司;維生素C,西隴科學有限公司;Mg、Ca、Fe、Cu、Mn、Cr、Pb、Na、Cd、Co、Zn、Ni、Li標準儲備液(1 000 μg/mL),國家鋼鐵材料測試中心鋼鐵研究總院;柚皮苷、過硫酸鉀、鐵氰化鉀、三氯乙酸、無水三氯化鐵,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;試劑均為分析純。

1.2 儀器和設備

Waters Alliance 2695高效液相色譜儀,美國Waters公司;UV-1800紫外-可見分光光度計,日本島津公司;TAS-990原子吸收分光光度計,北京普析通用儀器有限公司;N-1100V旋轉蒸發儀,上海愛朗儀器有限公司;FA2004電子分析天平,上海舜宇恒平科學儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品的制備

在各品種成熟季節,選取長勢一致、生長發育良好的植株,在樹體各個方向取大小均勻、果形正常、無病蟲害的成熟果實。鮮果洗凈、擦干、剝皮,果皮分為外皮層(含有皮脂腺)、中皮層(海綿狀)、囊衣(包裹汁胞的皮)、汁胞,共4個部位分別于50 ℃烘干,取粉末適量,用體積分數為95%的乙醇按料液比1：5(g：mL)于50 ℃超聲提取3次(200 W、100 Hz、30 min),合并提取液后減壓濃縮得到 95%乙醇浸膏,貯存,用于總酚、柚皮苷含量測定及抗氧化活性研究[12]。

1.3.2 含量測定

1.3.2.1 礦物質元素含量的測定

采用火焰原子吸收法測定礦物質元素含量[13],精確稱量4.000 0 g樣品粉末,置坩堝內,500 ℃下灼燒6 h至灰燼,冷卻后取出;灰分用稀硝酸(0.5 mol/L)溶解,置電阻爐中100 ℃加熱10 min,再加熱至500 ℃灰化30 min,重復上一步驟,直至坩堝中灰分能全部溶解于稀硝酸且無黑色炭顆粒;再用10 mL稀硝酸(0.5 mol/L)溶解灰分,移入50 mL容量瓶中,并潤洗坩堝3～5次,用超純水定容至刻度,備用,采用TAS-990型原子吸收分光光度計測定,樣品礦物質含量以每克干樣品(dry weight,DW)中含有的質量(μg/g DW)表示。

1.3.2.2 多酚含量的測定

多酚含量測定采用福林酚法[14],以沒食子酸(gallic acid,GA)為標準品繪制標準曲線,樣品多酚含量以每克干樣品中含有的沒食子酸質量(mg GA/g DW)表示。

1.3.2.3 柚皮苷含量的測定

柚皮苷含量測定采用高效液相法[15],色譜條件:0.04%磷酸水：乙腈(80：20),等度洗脫;柱溫為30 ℃;流速為 1 mL/min;檢測波長為283 nm;進樣量10 μL。取柚皮苷對照品適量,精密稱定,加 50%甲醇制成每1 mL含60 μg的溶液,微孔濾膜過濾,進樣,以柚皮苷質量濃度為橫坐標,峰面積為縱坐標繪制標準曲線。同法測定樣品中柚皮苷峰面積,代入標曲計算含量,含量以每克干樣品中含有的柚皮苷質量(mg/g DW)表示。

1.3.3 體外抗氧化活性分析

1.3.3.1 DPPH自由基清除能力測定

DPPH自由基清除能力的測定參考文獻[16]。分別精密移取1.0 mL不同質量濃度的樣品或維生素C溶液于10 mL試管中,分別加入0.1 mmoL/L DPPH甲醇溶液1.0 mL,室溫避光靜置20 min,以甲醇作為空白對照,于波長517 nm處測定吸光度(Ai);同時測定1.0 mL DPPH甲醇溶液與1.0 mL甲醇溶液混合后在波長517 nm處的吸光度(A0);測定1.0 mL甲醇溶液與1.0 mL樣品溶液在波長517 nm處的吸光度(Aj);每個樣品平行測定3次。根據公式(1)計算樣品對DPPH自由基的清除率。結果以維生素C當量表示,mg維生素C/g DW,根據公式(2)計算:

(1)

(2)

式中:IC50(維生素C),DPPH自由基清除率為50%的維生素C含量,mg/g;IC50(S),DPPH自由基清除率為50%的樣品含量,mg/g;1 000,單位換算。

1.3.3.2 ABTS陽離子自由基清除能力測定

ABTS陽離子自由基清除能力測定參考文獻[17]。將7.0 mmoL/L的ABTS溶液與2.45 mmoL/L過硫酸鉀溶液等體積混合,室溫避光靜置12～16 h,制備ABTS陽離子自由基母液。用10 mmoL/L (pH值7.4)磷酸緩沖溶液將ABTS陽離子自由基母液稀釋,使其在波長734 nm處吸光度達到0.70±0.02。分別將0.1 mL不同質量濃度樣品溶液或維生素C溶液加入4.0 mL ABTS陽離子自由基溶液中,振蕩30 s后室溫靜置10 min,于波長734 nm處測量吸光度(Ai);同時測定4.0 mL ABTS陽離子自由基溶液與0.1 mL甲醇溶液混合后在波長734 nm處的吸光度(A0);測定4.0 mL(10 mmoL/L;pH值7.4)磷酸緩沖溶液與1.0 mL樣品溶液在波長734 nm處的吸光度(Aj);每個樣品平行測定3次。根據公式(3)計算樣品對ABTS陽離子自由基的清除率。結果以維生素C當量表示,mg維生素C/g DW,根據公式(4)計算:

(3)

(4)

式中:IC50(維生素C),ABTS陽離子自由基清除率為50%的維生素C含量,mg/g;IC50(S),ABTS陽離子自由基清除率為50%的樣品含量,mg/g;1 000,單位換算。

1.3.3.3 鐵離子還原能力測定

鐵離子還原能力的測定參考文獻[18]。分別精密移取2.0 mL 不同質量濃度的樣品和維生素C溶液于10 mL 試管中,再分別加入2.0 mL 磷酸緩沖溶液(2.0 mol/L,pH值6.6)和2.0 mL 10 g/L鐵氰化鉀,搖勻,于50 ℃恒溫水浴20 min后取出急速冷卻,再分別加入2.0 mL 100 g/L三氯乙酸溶液。將上述溶液離心10 min(6 000 r/min),取上清液2.0 mL,加入1.5 mL 蒸餾水及0.5 mL 1 g/L FeCl3溶液混勻,靜置10 min后于700 nm測定吸光度,每個樣品平行測定3次,鐵離子還原能力大小以維生素C當量表示,mg維生素C/g DW。

抗氧化結果均以干質量計。采用抗氧化活性綜合(antioxidant potency composite,APC)指數法[公式(5)],對抗氧化活性進行系統的綜合評價[19]。計算如公式(5)所示:

(5)

1.4 統計學處理方法

2 結果與分析

2.1 礦物質元素含量

通過火焰原子吸收光譜法對13種礦物質元素進行檢測,6個品種柚子的外皮層、中皮層、囊衣、汁胞4個部位均檢測出了11種礦物質元素(Mg、Ca、Li、Na、Fe、Zn、Cu、Mn、Cr、Ni、Co),其中元素Pb和Cd未檢出(表1)。由表1可知,柚子含有豐富的Mg、Ca、Li、Na、Fe等元素,其中Mg和Ca元素含量較高,Mg元素含量最高可達(25 349.50±1.03) μg/g DW(三紅蜜柚外皮層)、Ca元素含量最高可達(14 704.50±1.08) μg/g DW(三紅蜜柚外皮層)。含量最低的均是Co元素,最低為(0.04±0.01)μg/g DW(四季柚汁胞)。

表1 六種柚子不同部位礦物質元素含量 單位:μg/g DWTable 1 Content of minneral elements in different parts of six pomelo cultivars

2.2 總酚含量

以沒食子酸質量濃度(μg/mL)為橫坐標,吸光度為縱坐標,制作標準曲線,如圖1-a所示,得到標準曲線的回歸方程為:Y=0.105 6X+0.025 7,R2=0.997 4,表明沒食子酸在質量濃度為2～10 μg/mL時與吸光度線性關系良好。6種柚子不同部位提取物總酚含量測定結果見圖1-b。各品種柚子外皮層、中皮層、囊衣的總酚含量均顯著高于汁胞(P<0.05),表明果皮(外皮層、中皮層、囊衣)的總酚含量高于汁胞,該結果與莊遠紅等[20]的報道相一致;其中總酚含量最高的是黃肉蜜柚外皮層,達(6.14±0.31) mg GA/g DW,該結果與于杰等[12]對重慶地方名柚‘真龍柚3號’的總酚含量測定結果接近。此外,蜜柚(白肉蜜柚、紅肉蜜柚、黃肉蜜柚、三紅蜜柚)總酚含量最高的部位是外皮層,而沙田柚和四季柚囊衣的總酚含量最高的部位是囊衣;該數據對以總酚為主要成分開發柚類食品時優選柚子品種及部位具有指導意義。

a-沒食子酸標準曲線;b-6種柚子不同部位總酚含量圖1 沒食子酸標準曲線及6種柚子不同部位總酚含量Fig.1 Gallic acid standard curve and total phenols content in different parts of six pomelo cultivars注:同一品種柚子柱形圖上相同英文字母表示差異性不顯著(P>0.05),不同英文字母表示差異性顯著(P<0.05)(下同)。

2.3 柚皮苷含量

2.3.1 柚皮苷標準曲線與系統適用性試驗

以柚皮苷質量濃度(mg/mL)為橫坐標,峰面積(μv/s)為縱坐標,制作標準曲線,如圖2-a所示,得到標準曲線的回歸方程為:Y=16 547 669.25X-5 554.17,R2=0.999 8,結果表明,柚皮苷在質量濃度為0.012 5～0.2 mg/mL時與峰面積線性關系良好。精密度試驗:取同一份柚皮苷對照品溶液,按1.3.2.3節的色譜條件,連續進樣6次,柚皮苷的峰面積RSD為1.0%,儀器精密度良好。重復性實驗:取同一批沙田柚囊衣樣品6份,按1.3.1節項下方法制備,按1.3.2.3節項下的色譜條件進樣,測得柚皮苷平均含量6.03 mg/g DW,RSD為1.9%。穩定性試驗:取同一份沙田柚囊衣樣品溶液,于0、4、8、12、24、48 h 分別測定,計算柚皮苷峰面積的RSD為2.2%,說明被測溶液在48 h內穩定。加樣回收率試驗:取0.05 g已知柚皮苷含量為6.03 mg/g DW的沙田柚囊衣樣品6份,精密稱定,精密加入0.25 mg的柚皮苷對照品,按1.3.1節方法制備,按照1.3.2.3節色譜條件進樣,結果平均回收率為100.05%,RSD為1.70%,表明本法加樣回收率較好,方法可行。6種柚子不同部位提取物柚皮苷含量測定結果見圖2-b。白肉蜜柚囊衣的柚皮苷含量與汁胞相比不具有顯著性差異,白肉蜜柚外皮層、中皮層及其他品種柚子外皮層、中皮層、囊衣的柚皮苷含量均顯著高于汁胞(P<0.05),即果皮(外皮層、中皮層、囊衣)的柚皮苷含量高于汁胞;其中黃肉蜜柚外皮層和中皮層的柚皮苷含量均大于其余品種同部位的柚皮苷含量,而黃肉蜜柚囊衣柚皮苷含量與紅肉蜜柚、三紅蜜柚、四季柚的囊衣柚皮苷含量接近,從整體上看黃肉蜜柚整果的柚皮苷含量大于其余品種的柚子。柚皮苷含量最高的部位是黃肉蜜柚中皮層,可達(11.95±0.06) mg/g DW。

a-柚皮苷標準曲線;b-6種柚子不同部位柚皮苷含量圖2 柚皮苷標準曲線及6種柚子不同部位柚皮苷含量Fig.2 Naringin standard curve and naringin content in different parts of six pomelo cultivars

2.4 體外抗氧化活性

2.4.1 DPPH自由基清除能力

6種柚子不同部位對DPPH自由基清除能力見圖3。6種柚子不同部位均具有一定的DPPH自由基清除能力,除三紅蜜柚外皮層清除DPPH自由基的能力低于囊衣層,其余品種柚子外皮層清除DPPH自由基的能力均最高,且顯著強于中皮層、囊衣、汁胞(P<0.05),汁胞最弱。表明柚子外皮層清除DPPH自由基能力較強。其中DPPH自由基清除能力最強的是黃肉蜜柚外皮層,可達(12.31±2.12) mg維生素C/g DW。

圖3 六種柚子不同部位對DPPH自由基清除能力Fig.3 Evaluation of DPPH radical activity in different parts of six pomolo cultivars

2.4.2 ABTS陽離子自由基清除能力

6種柚子不同部位對ABTS陽離子自由基清除能力見圖4。6種柚子不同部位均具有一定的ABTS陽離子自由基清除能力,紅肉蜜柚、三紅蜜柚、四季柚、沙田柚的囊衣清除ABTS陽離子自由基的能力顯著強于其他部位(P<0.05),而白肉蜜柚和黃肉蜜柚均為外皮層的ABTS陽離子自由基清除能力最強。除白肉蜜柚外,其余品種汁胞清除ABTS陽離子自由基的能力顯著低于外皮層、中皮層、囊衣(P<0.05)。整體上看,柚子囊衣清除ABTS陽離子自由基的能力較強,汁胞最弱。其中四季柚囊衣部位對ABTS陽離子自由基清除能力最強,可達(173.03±4.05) mg維生素C/g DW。

圖4 六種柚子不同部位對ABTS陽離子自由基清除能力Fig.4 Evaluation of ABTS cationic radical activity in different parts of six pomelo cultivars

2.4.3 鐵離子還原能力的測定

6種柚子不同部位對鐵離子還原能力的影響見圖5, 6種柚子不同部位均具有一定的鐵離子還原能力。白肉蜜柚、三紅蜜柚、黃肉蜜柚、四季柚的外皮層的鐵離子還原能力均顯著大于其余部位(P<0.05)。紅肉蜜柚外皮層鐵離子還原能力顯著大于中皮層、囊衣(P<0.05),但與汁胞接近。沙田柚外皮層鐵離子還原能力顯著低于汁胞(P<0.05)。整體上看,柚子外皮層的鐵離子還原能力較強。其中,鐵離子還原能力最強的是四季柚外皮層,可達(30.42±1.77) mg維生素C/g。

圖5 六種柚子不同部位對鐵還原能力的影響Fig.5 Evaluation of reducing ferric in different parts of six pomelo cultivars

2.4.4 抗氧化活性的APC指數分析

6種柚子不同部位的APC指數及綜合排序見表2。外皮層的APC綜合指數均值排序依次為:黃肉蜜柚>四季柚>白肉蜜柚>紅肉蜜柚>三紅蜜柚>沙田柚,表明外皮層部位綜合抗氧化活性最強的是黃肉蜜柚,沙田柚最弱。中皮層的APC綜合指數均值排序依次為:四季柚>黃肉季柚>白肉蜜柚>沙田柚>紅肉蜜柚>三紅蜜柚,表明中皮層部位綜合抗氧化活性最強的是四季柚,三紅蜜柚最弱。囊衣的APC綜合指數均值排序依次為:四季柚>黃肉蜜柚>沙田柚>三紅蜜柚>紅肉蜜柚>白肉蜜柚,表明囊衣部位綜合抗氧化活性最強的是四季柚,白肉蜜柚最弱。汁胞APC綜合指數均值排序依次為:四季柚>紅肉蜜柚>沙田柚>三紅蜜柚>白肉蜜柚>黃肉蜜柚,表明汁胞綜合抗氧化活性最強的是四季柚,黃肉蜜柚最弱。綜合抗氧化活性指數表明,外皮層抗氧化活性最強的品種是黃肉蜜柚,其他部位抗氧化活性最強的品種均是四季柚。

表2 抗氧化綜合評級Table 2 Comprehensive antioxidant rating

2.5 總酚、柚皮苷含量與抗氧化活性的相關性分析

6種柚子不同部位的總酚、柚皮苷含量與抗氧化活性的相關性分析結果見表3。由表3可知,柚子外皮層、中皮層、囊衣的總酚、柚皮苷含量與ABTS陽離子自由基清除能力呈極顯著相關(P<0.01)。柚子總酚、柚皮苷含量與DPPH自由基清除能力和鐵離子還原能力的相關性較低。表明總酚和柚皮苷是柚類發揮ABTS陽離子自由基清除能力的物質基礎。值得注意的是,汁胞總酚、柚皮苷含量與鐵離子還原能力呈負相關,但汁胞具有良好的鐵離子還原能力,其可能原因在于汁胞中總酚、柚皮苷之外的其他物質發揮了抗氧化活性作用,如汁胞中富含的維生素C[21]、可溶性糖[22]等。

表3 相關性分析Table 3 Correlation analysis

3 結論

本實驗對梅州產 6個品種的柚果及其4個部位的礦質元素、總酚、柚皮苷及抗氧化活性進行了系統評價,結果顯示6種柚子均含有豐富的礦質元素,其中Mg和Ca元素含量較高,Mg元素最高可達(25 349.50±1.03) μg/g DW(三紅蜜柚外皮層)、Ca元素最高可達(14 704.50±1.08) μg/g DW(三紅蜜柚外皮層);黃肉蜜柚外皮層總酚含量最高,達(6.14±0.31) mg GA/g DW;黃肉蜜柚中皮層柚皮苷含量最高,達(11.95±0.06) mg/g DW;綜合抗氧化活性指數顯示外皮層抗氧化活性最強的品種是黃肉蜜柚,中皮層、囊衣、汁胞部位抗氧化活性最強的品種均是四季柚。總酚、柚皮苷的含量與ABTS陽離子自由基清除能力呈極顯著性正相關(P<0.01)。本實驗明確了梅州地區主產的6種品種及其不同部位礦物質元素、總酚、柚皮苷含量及抗氧化活性差異,為更科學、更精細化地開發利用梅州產柚類資源提供了理論依據。