生物原料蛋白胨中重要成分的超高效液相色譜-串聯質譜定量分析方法

田夢園 張進 國果 李博巖

1（貴州醫科大學公共衛生與健康學院， 環境污染與疾病監控教育部重點實驗室， 貴陽 550025）

2（貴州醫科大學基礎醫學院， 貴陽 550025）

蛋白水解物（Protein hydrolysate）又稱蛋白胨，是蛋白質經酸、堿和酶不完全水解而得到的水溶性混合物。蛋白胨按來源可分為植物源、動物源和微生物源。蛋白胨富含多種營養補充因子，因此被廣泛用于食品、微生物培養和醫藥等領域[1]。尤其是以哺乳動物細胞表達的治療性抗體和功能性蛋白為主的現代生物制藥，越來越多地使用動物源蛋白胨，用于改善細胞生長特性和提高容積效率。蛋白胨的化學組成復雜，含有細胞生長所需要的多種氨基酸、肽、碳水化合物、維生素、微量元素和生長因子等物質[2]，具有促進細胞增殖、抗凋亡、抗氧化和抗菌等生物活性[3]，能夠顯著提高細胞的增長速度和降低細胞培養成本。其中，氨基酸、鳥嘌呤和腺嘌呤是供給細胞營養的核心成分，參與細胞呼吸、合成三磷酸腺苷，促進蛋白質、DNA 和RNA 合成[4]，可作為蛋白胨質量評價的重要指標。然而，這些物質的穩定性以及含量易受溫度、濕度、濃度和光照條件等因素影響[5]，致使蛋白胨的生物性能與使用價值降低。因此，準確分析和表征蛋白胨樣本中的化學成分是一個具有挑戰性的難題。目前，蛋白胨的研究主要集中在制備方法[6]、含量測定[7-11]和細胞培養應用[1]等方面，有關貯存條件等影響其成分變化以及質量穩定性的關鍵因素的研究卻鮮有報道。

熒光、拉曼和近紅外光譜技術與化學計量學方法結合適用于大規模原材料的篩選與質量鑒定，可以實現樣品的快速無損分析，是表征樣品質量與批次變化的最常用方法[12]，但難以滿足蛋白胨溶液成分變化的解析要求。傳統的高效液相色譜法測定氨基酸，通常需要衍生化處理，存在操作繁瑣、破壞樣本、成本昂貴、衍生產物易污染儀器以及重現性差等缺點。超高效液相色譜-串聯質譜技術（UHPLCMS/MS）具有超高效液相色譜的快速分離與質譜的高分辨檢測能力，對復雜基質樣品進行分析具有顯著優勢[13]。

本研究利用UHPLC-MS/MS 技術，無需衍生化處理，直接測定蛋白胨樣品溶液中16 種重要化合物的含量，建立了一種準確、高效分析蛋白胨的方法。通過考察不同貯存溫度條件下多組分含量的變化，確定蛋白胨樣品的適宜貯存和使用條件，為蛋白胨的質量評估和控制提供了參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Qsight LX50 超高效液相色譜儀、Qsight 210 三重四極桿質譜儀（美國珀金埃爾默公司）；120D 分析天平（日本島津公司）；ST8R 臺式高速冷凍離心機（美國賽默飛公司）；PHS-25 雷磁pH 計（上海儀電公司）；Syncronis HILIC 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm，美國賽默飛公司）；Accucore C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm，美國賽默飛公司）；Raptor Polar X 色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.7 μm，美國RESTEK公司）。

蛋白胨（美國Merck 公司）。標準品：鳥嘌呤（Guanine）、腺嘌呤（Adenine） （HPLC 級，≥98%，南京草本源生物科技有限公司）；脯氨酸（Pro） （HPLC 級，≥99%，美國Merck 公司）；天冬氨酸（Asp）、絲氨酸（Ser）、谷氨酸（Glu）、精氨酸（Arg）、蘇氨酸（Thr）、酪氨酸（Tyr）、纈氨酸（Val）、賴氨酸（Lys）、亮氨酸（Leu）、異亮氨酸（Ile）、苯丙氨酸（Phe）、色氨酸（Trp）和丙氨酸（Ala） （HPLC 級，≥98%），上海生工生物工程公司。甲酸（LC-MS 級，美國CNW 公司）；乙酸銨（LC-MS 級，美國Merck 公司）；乙腈（HPLC級，≥99.9%，美國Merck 公司）。蒸餾水（香港屈臣氏有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液制備

分別稱取16 種標準物質各25.0 mg， 用0.10 mol/L HCl 溶解并定容至25 mL， 制備1.00 g/L 的標準儲備液，于-20 ℃避光保存。

移取適量的各標準品溶液，混合后用1%甲酸-乙腈溶液稀釋，制備一系列混合標準溶液，各物質的濃度分別為Trp:0.01、0.05、0.10、0.20、0.40、0.80、1.60、2.00 mg/L；Phe、Leu、Ile:0.01、0.05、0.10、0.50、1.00、5.00、10.00、15.00 mg/L；Tyr、Val: 0.10、0.50、1.00、2.00、5.00、8.00、10.00、15.00 mg/L；Pro: 0.05、0.10、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、5.00 mg/L；Ala: 0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mg/L；Thr、Ser、Arg、Lys、Glu、Asp: 0.20、0.50、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mg/L；Adenine:0.005、0.01、0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mg/L；Guanine:0.01、0.05、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mg/L。溶液現用現配。

1.2.2 樣品溶液制備

稱取1.60 g 樣品，以超純水溶解并定容至100 mL。取100 μL 溶液至2 mL 離心管中，加入900 μL 1%甲酸-乙腈溶液，4 ℃下以14000 r/min 離心5 min， 取上清液100 μL，與900 μL 90%乙腈混勻，過0.22 μm 濾膜后，待測。所有操作均在避光條件下完成。

1.2.3 不同貯存溫度條件下的樣品分析

取5 個不同貯存溫度（-80、-40、-20、4 和25 ℃）下的貯存樣品溶液，用UHPLC-MS/MS 方法分別于第0、2、4、6、8、15 和30 天分析樣品溶液中的14 種氨基酸和腺嘌呤、鳥嘌呤的含量，并測量溶液的pH 值。各實驗重復3 次。

1.2.4 液相色譜條件

RESTEK Raptor Polar X 色譜柱（100 mm × 2.1 mm， 2.7 μm）；保護柱過濾器：Thermo Scientific?UHPLC filters（2.1 mm×0.2 μm，美國賽默飛公司）；流動相A 為0.5%甲酸溶液，流動相B 為90%乙腈溶液（含有20.0 mmol/L 乙酸銨）。梯度洗脫：0～2.0 min，2% A；2.0～15.0 min，2%～15% A；15.0～20.0 min，15%～30% A；20.0～21.0 min，30%～12% A；21.0～23.0 min，12% A；23.0～25.0 min，12%～2% A；25.0～30.0 min，2% A。柱溫：20 ℃；樣品室溫度：4 ℃；流速：0.30 mL/min；進樣量：10 μL。

1.2.5 質譜條件

電噴霧離子源（ESI），正離子多反應監測模式（MRM）；ESI 噴霧電壓：5850 V；反吹干燥氣流速：120 L/h；霧化器流速：220 L/h；熱表面誘導去溶劑質譜接口溫度：320 ℃；離子源溫度：350 ℃。各目標物的質譜檢測參數見表1。

表1 16種化合物的質譜檢測參數與色譜保留時間信息Table 1 Mass spectrometric (MS) parameters and chromatographic retention time of 16 kinds of compounds

1.3 數據分析

使用MATLAB R2021b 軟件（MATHWORKS）進行數據方差分析（ANOVA）、Tukey′s HSD 檢驗和主成分分析（PCA），以p＜0.05 表示有顯著性差異，具有統計學意義。數據一般以平均值±標準偏差表示。

2 結果與討論

2.1 分析條件優化

2.1.1 色譜柱的選擇

氨基酸多屬于極性較強的化合物，通常采用親水性色譜柱進行分離。本研究考察了Thermo Syncronis HILIC （100 mm × 2.1 mm，1.7 μm）、Accucore C18（100 mm × 2.1 mm，2.6 μm）和RESTEK Raptor Polar X（100 mm×2.1 mm，2.7 μm）3 種色譜柱對氨基酸的分離性能（見電子版文后支持信息圖S1）。在相同的色譜洗脫條件下分離16 種混合標準溶液，RESTEK Raptor Polar X 柱的分離效果最好（圖1A）；HILIC 柱的粒徑較小、平衡時間長、柱壓高，并且分離度不及Raptor 柱；C18柱分離效果最差。上述結果說明，傳統的反相色譜柱不適合分離未衍生的氨基酸物質，因此，本研究選擇Raptor 色譜柱。

圖1 （A）16 種標準品混合物與（B）樣品溶液中16 種化合物的定量離子流圖Fig.1 Quantitative production ion chromatograms of (A) 16 kinds of standards mixture and (B) 16 kinds of compounds in hydrolysate solution

2.1.2 流動相的優化

以乙腈和水為基礎流動相，系統研究了甲酸和乙酸銨作為調節劑對目標化合物的色譜峰形和分離效果的影響。當水相中加入0.1%甲酸時，多數化合物的色譜峰響應低、分離度差；隨著甲酸濃度增加，目標化合物的峰形與強度都有所改善；當甲酸濃度為0.5%、pH=2.25 時，色譜峰形與響應都較好（見電子版文后支持信息圖S2）。在乙腈流動相中添加20.0 mmol/L 乙酸銨且pH=5.20 時，各化合物能得到很好分離與準確定量（圖1A，電子版文后支持信息圖S3）。

2.1.3 質譜條件的優化

通常，氨基酸為兩性化合物，在正離子模式下的響應更強。采用質譜多反應監測（MRM）模式，優化駐留時間等參數有效分離和檢測氨基酸、鳥嘌呤和腺嘌呤等（表1）。在優化的色譜質譜條件下所得的蛋白胨樣品溶液中16 種目標化合物的定量離子流圖見圖1B，16 種化合物的色譜峰形較好、分離度高。

2.2 方法學驗證

2.2.1 方法的線性關系、檢出限和定量限

測定標準物質混合溶液，計算各物質濃度（x）與其在特定離子峰下的色譜峰面積（y），擬合數據得到16 種物質的線性回歸方程和線性相關系數（R2），結果見表2，16 種化合物在各自質量濃度范圍內線性關系良好，R2均大于0.99。

表2 16種化合物的線性范圍、回歸方程、線性相關系數（R2）、檢出限（LOD）和定量限（LOQ）Table 2 Linear ranges, regression equations, determination coefficients, limits of detection (LODs) and limits of quantification(LOQs) of 16 kinds of compounds

采用逐步稀釋低濃度標準溶液的方式，選取各物質色譜峰附近基線為參照，計算信噪比（S/N），以S/N≥3 且符合定性要求的物質的最低濃度為檢出限（LOD），以S/N≥10 且滿足精密度和準確度要求的物質的最低濃度為定量限（LOQ），計算各化合物的檢出限與定量限（表2）。與文獻[13]的分析方法相比，本研究提出的UHPLC-MS/MS 方法定量分析蛋白胨溶液中16 種化合物具有更低的檢出限和定量限。

2.2.2 精密度、重復性和穩定性

取適量混合標準品溶液，連續測定6 次，計算各物質色譜峰面積的相對標準偏差（RSD），RSD 在1.08%～2.16%之間（電子版文后支持信息表S1），表明儀器精密度較好。與文獻[13]的分析方法相比，本研究提出的UHPLC-MS/MS 方法定量分析蛋白胨溶液中16 種化合物更準確，精密度更優。

準確稱取蛋白胨粉末樣本1.60 g，共6 份，分別制備溶液并測定其中的16 種目標物質對應的色譜峰面積。16 種物質含量的RSD 在1.40%～4.94%范圍內（電子版文后支持信息表S1），表明本方法的重復性較好。

取同一批次蛋白胨樣本，制備成溶液后，分別在0、6、12、18 和24 h 進行UHPLC-MS/MS 檢測分析。結果表明，16 種目標物質的色譜峰面積的RSD 在0.75%～4.68%之間（電子版文后支持信息表S1），樣品溶液在24 h 內具有較好的穩定性。

2.2.3 加標回收率

稱取蛋白胨粉末1.60 g，共9 份，每3 份為1 組，分別加入3 個水平的混合標準品溶液適量，測定樣品溶液各目標物質對應的色譜峰面積，計算含量和加標回收率（電子版文后支持信息表S2）。結果表明，16 種物質的平均加標回收率在91.7%～106.7%之間，相對標準偏差≤5.63%（n= 3）。

2.3 貯存溫度對樣品組成的影響

考察了不同貯存溫度（-80、-40、-20、4 和25 ℃）下的蛋白胨樣品溶液pH 值隨貯存時間的變化關系。如圖2 所示，當貯存溫度為-80、-40 和-20 ℃時，貯存30 d 后，樣品溶液的pH 值穩定，對應的均值與標準偏差分別為（7.024±0.024）、（7.022±0.020）和（7.022±0.018）。當貯存溫度為25 ℃時，樣品溶液的pH 值從最初（0 d）的（7.003±0.006）迅速降至第2 天的（6.413±0.035），然后逐漸上升，直至第30 天達到（8.350±0.010），與冷凍溫度條件下相比，pH 值增加了1.35。這主要因為樣品溶液中含量較高的葡萄糖在較高溫度下易被微生物消耗，由糖酵解反應生成的酸性物質導致溶液pH 值下降[14]，隨著貯存時間延長，微生物在內源酶的作用下分解蛋白質而產生氨及胺類等堿性含氮物質，如氨、甲胺、二甲胺和三甲胺等其它類似化合物，使pH 值逐漸增大[15]。當貯存溫度為4 ℃時，第8 天時樣品溶液的pH 值達到最小（6.73±0.015），之后逐漸增加，第30 天的pH 值達到7.800±0.020。這說明較低溫度（如4 ℃）在一定程度上抑制了樣本溶液的生物活性，但在較長貯存時間內，樣本組分仍然發生本質性改變。

圖2 蛋白胨樣品溶液在不同貯存溫度下pH 值隨貯存時間的變化圖Fig.2 pH value changes of hydrolysate solution over storage time at different temperatures

-80、-40 和-20 ℃冷凍溫度條件下貯存30 d 后的蛋白胨樣品溶液依然澄清，還保持有蛋白胨新鮮溶液固有的淡黃色，感官性狀未見明顯變化。4 和25 ℃條件下，隨著貯存時間延長，溶液顏色變深，渾濁度增加，并產生少量沉淀，帶有明顯的蛋白質變質氣味。鐵介導的色氨酸氧化可能是樣本溶液顏色變深的一個重要原因[16]。另外，溶液中存在的銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）適宜在25 ℃生長，產生的水溶性色素而使樣本溶液顏色變深、偏紅。含硫氨基酸在變質過程中產生硫化物，通過自由基反應形成硫化氫，使其具有異味[17]。產生沉淀的原因可能是受到氨基酸電荷和溶解度的綜合影響，與溶液的pH 值、貯存溫度及樣本濃度相關[18]。

上述結果表明，不同貯藏溫度下的樣品溶液的pH 值、感官性狀（電子版文后支持信息圖S4）以及各物質的含量明顯變化的時間點基本一致。

2.4 樣品成分含量變化

2.4.1 方差分析

對不同溫度條件下各貯存時間點的樣本溶液進行UHPLC-MS/MS 檢測，分析關鍵成分的含量變化（電子版文后支持信息表S3～S5，表3 和表4）。單因素方差分析結果顯示，貯存溫度為-80、-40 和-20 ℃時，不同時間點的各物質含量無統計學意義上的差異（p＞0.05），表明蛋白胨樣品在冷凍條件下貯存，30 d 內化學成分與樣本質量均相對穩定，基本不會影響樣本的生物性能和使用情況。

表3 4 ℃條件貯存的蛋白胨中各物質含量（mg/L）的方差分析結果Table 3 Analysis of variance (ANOVA) result of the compositional content (mg/L) in hydrolysate solution stored at 4 ℃

表4 25 ℃條件下貯存的蛋白胨中各物質含量（mg/L）的方差分析結果Table 4 ANOVA result of the compositional content (mg/L) in hydrolysate solution stored at 25 ℃

貯存溫度為4 和25 ℃時，纈氨酸和賴氨酸的含量呈現輕微上升趨勢（p＜0.05），脯氨酸含量基本不變，不受貯存時間影響（p＞0.05）。其它物質得含量隨著貯存時間延長而顯著降低（p＜0.05）。單因素方差分析結果表明，4 和25 ℃條件下樣品中物質含量與不同貯存時間之間存在顯著性差異（p＜0.05）。采用圖基檢驗（Tukey′s post hoc test）分析樣品溶液在7 個貯存時間點（0～30 d）檢測所得各物質的含量，結果見表3 和表4，表中相同行內不相同的小寫字母標記表示各化合物在不同貯存時間點之間的差異顯著（p＜0.05）。

貯存溫度為4 ℃時，與初始含量（第0 天）相比，除脯氨酸之外的15 種物質含量發生顯著性變化（p＜0.05）的時間均為第8 天。含量呈下降趨勢的13 種物質在第8 天的相對含量降低了3.75%～52.00%，在第30 天降低了11.14%～71.56%。其中，天冬氨酸含量（2.25 mg/L， 第0 天）的降低幅度最大，分別為52.00%（第8 天）和71.56%（第30 天）。可能的原因是天冬氨酸是一種酸性α-氨基酸，在轉氨酶作用下易分解為其它物質或轉化成賴氨酸等。其它物質含量的降低幅度為：谷氨酸（33.33%～58.56%）＞腺嘌呤（20.00%～60.00%）＞蘇氨酸（19.49%～48.01%）＞絲氨酸（18.26%～35.68%）＞鳥嘌呤（18.18%～40.91%）＞酪氨酸（14.97%～29.94%） ＞異亮氨酸（11.92%～36.27%） ＞苯丙氨酸（10.34%～24.14%） ＞丙氨酸（9.46%～37.16%）＞精氨酸（7.91%～18.24%）＞色氨酸（7.69%～15.38%）。樣本中谷氨酸的含量較高（3.33 mg/L@day 0）。游離的谷氨酸是一種微酸性氨基酸，參與溶液中微生物的許多代謝或化學反應而易被消耗，因此其含量隨貯存時間增長（＞8 d）迅速降低。腺嘌呤，即維生素B4，為輔酶和核酸的組成成分，是樣品釋放能量的關鍵，可能因為參與糖、蛋白質等的代謝，其含量在貯存8 d 后顯著減少。溶液中的蘇氨酸可在生物酶（如脫水酶、蘇氨酸脫酶、醛縮酶）的作用下轉變為其它的氨基酸物質，致使含量降低。絲氨酸是中性脂肪族含羥基氨基酸，可以異生為糖類物質，參與代謝或供能，或在脫水酶催化下脫水脫氨生成丙酮酸而被消耗，導致含量降低。亮氨酸含量隨貯存時間延長而下降的幅度最小，分別減少了3.75%（第8 天）和11.14%（第30 天）。亮氨酸與異亮氨酸都是支鏈氨基酸，能夠分解轉化為葡萄糖而被消耗，其含量在貯存8 d 后也明顯降低。

蛋白胨樣本中富含賴氨酸（5.68 mg/L，第0 天），其含量在貯存第8 天時增加到6.21 mg/L，增加幅度為9.33%；在第30 天達到7.02 mg/L，增加幅度為23.59%。賴氨酸為堿性生酮氨基酸，在樣品溶液中一般不參與轉氨基作用。賴氨酸的增加可能源于天冬氨酸經過反應在還原酶和脫氫酶作用下生成α-氨基乙二酸。蛋白胨富含蛋白質，發酵水解后也產生賴氨酸。蛋白胨是水解產物，4 ℃時為微生物桿菌（如谷氨酸棒狀桿菌和乳糖發酵短桿菌）發酵提供了可行條件。纈氨酸含量在第8 天和第30 天分別提高了5.99%和32.97%。微生物發酵法是一種常見且經濟的L-型纈氨酸生產方法，4 ℃長期貯存條件致使樣本溶液易發酵，纈氨酸含量增加。

與4 ℃的貯存溫度相比，25 ℃更溫和、更適合蛋白胨樣本中微生物發酵與化學反應，因此溶液組分份變質更快、時間更短。異亮氨酸和丙氨酸的含量在第4 天發生顯著性變化（p＜0.05），分別降低了11.46%和17.43%。纈氨酸的含量在第6 天增加了32.41%（p＜0.05）。11 種化合物的含量在第2 天發生了顯著性減少（p＜0.05）：腺嘌呤（40.00%）、谷氨酸（25.83%）、天冬氨酸（23.29%）、鳥嘌呤（18.60%）、絲氨酸（16.67%）、酪氨酸（16.05%）、苯丙氨酸（15.69%）、蘇氨酸（7.91%）、精氨酸（7.80%）、色氨酸（5.13%）、亮氨酸（2.11%）。賴氨酸含量在第2 天顯著性增加了6.11%（p＜0.05）。貯存30 d 時，這些物質含量降低的最小幅度達15.02%（亮氨酸），最大幅度為82.19%（天冬氨酸），腺嘌呤的降解率高達80.00%。纈氨酸和賴氨酸含量在30 d 內分別上升了44.32%和26.70%。總之，4 和25 ℃兩種溫度條件下天冬氨酸和腺嘌呤的降解率最高。這些結果表明貯存溫度是影響蛋白胨化學組成與質量穩定性的重要因素。其中，-80 ℃適合蛋白胨樣本長期保存，-20 ℃條件下至少可以貯存1 個月，2～4 ℃冷藏7 d 后樣本會變質，25 ℃的室溫下樣本存放1～2 d 就會變質。

圖3 為5 個溫度條件下，不同貯存時間點蛋白胨中各目標化合物含量變化熱圖，顯示了15 種物質含量的顯著性差異動態變化（n=3）。在非冷凍貯存過程中，蛋白胨的物質含量變化是一個復雜過程。微生物在適宜的溫度條件下迅速繁殖，同時消耗其中的營養成分導致樣品變質，這是造成樣品組成物質含量隨貯存時間變化的主要原因。25 ℃更利于多數微生物的生長，分解消耗營養物質的速率更快。多數氨基酸以及腺嘌呤和鳥嘌呤在微生物的脫氨基作用下發生降解，如氨基酸脫氨生成α-酮酸和氨[19]，絲氨酸和蘇氨酸可在脫水酶催化下脫水脫氨，生成酮酸和氨。脫氨基作用產生的氨不斷積累，對細胞培養有抑制和毒性作用，因而影響蛋白胨的生物性能。脫羧基作用也是氨基酸分解的途徑之一。在氨基酸脫羧酶的作用下脫羧生成二氧化碳和胺類化合物，如酪氨酸和色氨酸（以及組氨酸）分別轉化為酪胺和色胺（及組胺）[20]。乳酸菌、微球菌和葡萄球菌等微生物含有蛋白酶、脂肪酶和氨基酸脫羧酶，可促進蛋白質分解為氨基酸[21]，這可能是導致一些氨基酸含量增加的原因之一。

圖3 5 個不同貯存溫度條件下不同時間點的蛋白胨溶液中各物質含量動態變化圖: （A） -80 ℃；（B）-40 ℃；（C）-20 ℃；（D）4 ℃；（E）25 ℃Fig.3 Heatmap of temporal changes of content of 15 kinds of compositions in hydrolysate solution over storage time at five temperatures: (A) -80 ℃; (B) -40 ℃; (C) -20 ℃; (D) 4 ℃; (E) 25 ℃

此外，樣品中的氨基酸與其含有的金屬離子、糖類和維生素等發生反應，如氨基酸與還原糖的非酶促Maillard 反應也可能導致氨基酸含量顯著下降。25 ℃條件下，隨pH 值升高，可能發生的Maillard 反應強度增大[22]。多數水溶性維生素也是輔酶或輔基的主要成分，在細胞培養過程中發揮重要作用，如維生素B6 參與氨基酸代謝，提供重要的轉氨酶及脫羧酶的輔酶，促進氨基酸的降解[23]。

2.4.2 主成分分析

主成分分析（Principal component analysis，PCA）是一種常用的多元統計方法，用于無監督模式下提取數據特征。針對4 和25 ℃貯存條件下樣品在不同貯存時間所測得的16 種物質含量，經過歸一化和中心化方法處理3 次重復實驗數據后，進行PCA。3 個主成分解釋了4 ℃條件下的樣本物質含量數據的99.06%的方差。圖4 給出了第1 個主成分（PC1）對第2 個主成分（PC2）的主成分得分圖。顯然，從第0 天至第6 天，16 種物質的含量變化不顯著，對應的主成分得分值相近，分布在95%的置信區域內（即橢圓形區域）；然而在第8 天、第15 天和第30 天時含量發生明顯變化，對應的得分值差異較大。3 次實驗的重復性較好。

圖4 4 ℃條件下貯存30 d 后樣品溶液中16 種物質含量的主成分分析得分圖Fig.4 Principal component analysis(PCA)score plot of the content of 16 kinds of compositions in hydrolysate solution during a period of 30 days stored at 4 ℃

25 ℃條件下樣品溶液的物質濃度變化迅速。為更細致監測樣品變化的時間節點，實驗增加了6、12、18 和24 h 這4 個時間點的物質含量數據。PCA 模型的3 個主成分解釋了98.26%的數據方差。得分圖（圖5）顯示在1 d 內的貯存時間點樣品含量變化不顯著（p＜0.05），從第2 天至第30 天的每個貯存時段的樣品組成含量均發生明顯改變，并且彼此顯著不同。PCA 結果進一步說明樣本在25 ℃條件下存放1～2 d，其生物性能就發生改變，不可再使用。

圖5 25 ℃條件下貯存30 d 后樣品溶液中16 種物質含量的主成分分析得分圖Fig.5 PCA score plot of the content of 16 kinds of compositions in hydrolysate solution during a period of 30 d stored at 25 ℃

3 結論

通過優化UHPLC-MS/MS 實驗參數，建立了蛋白胨溶液中氨基酸、鳥嘌呤和腺嘌呤等16 個重要成分的定量分析方法，本方法具有良好的準確性與精確性。貯存溫度是引起蛋白胨成分含量變化的重要因素。結果表明，樣品在-20 ℃以下冷凍溫度保存30 d 質量穩定；樣品不宜在4 和25 ℃條件下儲藏，多數化合物易發生降解反應。不同貯藏溫度下的樣品溶液的pH 值、感官性狀以及各物質的含量明顯變化的時間點基本一致。因此，可以通過測定樣本溶液的pH 值與感官性狀變化，大致判斷蛋白胨的質量狀態，為合理使用蛋白胨提供了參考。