在線固相萃取-超高效液相色譜-串聯質譜法檢測水中15種三嗪類農藥

張恒 陳苗 孫善偉 孫曉雷 侯嵩 郭昌勝徐建 孫文軍

1（中國環境科學研究院環境健康風險評估與研究中心， 北京 100012）

2（國家環境保護化學品生態效應與風險評估重點實驗室， 北京 100012）

3（新疆阿克蘇地區環境保護監測站， 阿克蘇 843000）

4（沃特世科技（上海）有限公司， 上海 201206）

三嗪類農藥（Triazine pesticides，TPs）是一類高效選擇性除草劑，具有化學性質穩定、適用范圍廣等特點[1-2]。TPs 分子具有低水溶性，易吸附到土壤中，并隨著降水、徑流和沉降等方式進入環境，長期存在于環境介質中[3]。中國、希臘和法國等多個國家[4-6]的地表水和海洋中頻繁檢出三嗪類除草劑。我國長江、黃河、太湖和松花江等重點流域地表水中阿特拉津（一種三嗪類農藥）檢出率為100%，平均濃度范圍在7.0～1289.5 ng/L 之間，濃度差異較大[7-8]；其它三嗪類農藥（如撲草凈、撲滅津和莠滅凈）在萊州灣海域也均有檢出（未檢出～29.4 ng/L）[9]，其中，撲草凈在黃渤海沿岸海域中最高濃度達627.5 μg/L[6]。TPs 具有一定的致癌性和免疫毒性[10-11]，如阿特拉津可使雄性青蛙雌性化[12]；水中的莠滅凈可能導致腎臟充血、低血壓等疾病[10，13-14]；TPs 可以結合受體激素，干擾中樞神經和大腦發育[15]。多個國家將阿特拉津、西瑪津和嗪草酮等TPs 列入內分泌干擾劑化合物名單[16]，如美國環保署規定飲用水中阿特拉津和西瑪津含量分布不得超過3 和4 μg/L[17]，我國《水環境質量標準》（GB 3838—2002）[18]集中式生活飲用水特定項目標準限值中也規定了三嗪類除草劑阿特拉津的濃度不得超過3 g/L。我國地表水環境中TPs 殘留情況比較普遍，同時具有濃度差異大的特點，因此，開發高靈敏度、多種TPs 同時快速測定的方法十分必要。

目前，水體中農藥常用的檢測方法包括氣相色譜法（GC）、氣相色譜-質譜聯用法（GC-MS）[19]、高效液相色譜法（HPLC）[20]和液相色譜-串聯質譜法（HPLC-MS/MS）[21]等。Djozan 等[19-20]使用GC-MS 測定水中阿特拉津、西瑪津、撲滅津和撲草凈，檢出限在20～80 μg/L 之間，HPLC 測定大豆中西瑪津、阿特拉津、莠滅凈、撲滅津和特丁津5 種TPs 的檢出限在0.668～1.16 μg/L 之間。與GC-MS/MS 相比，使用HPCC-MS/MS 對水樣預處理的要求更低，并且該方法具有更低的檢出限、更寬的適用范圍和更好的分析性能[22-23]。李少飛等[24]使用HPLC-MS/MS 測定地表水和地下水中的阿拉特津，檢出限低至20 ng/L。

水體中TPs 的污染物整體賦存水平較低，直接進樣法雖然便捷快速，但難以滿足部分農藥類物質的靈敏度需求，需富集后測定。常用的富集前處理方法包括固相萃取（Solid phase extraction，SPE）[25]、超聲萃取[26]和索氏萃取[27]等。索氏萃取耗費時間長，有機溶劑使用量大，萃取過程中目標物質可能會受熱分解；超聲萃取和固相萃取相較于索氏萃取具有有機溶劑消耗低、萃取效率高的優點，但成本高，費時費力。在線固相萃取技術（Online-SPE）與傳統的固相萃取相比，上樣時間由1～2 h 縮短到幾分鐘，水樣體積由幾百毫升降低至幾毫升，樣品采集、運輸及保存的便捷性顯著提升。同時，Online-SPE 自動化程度高，能夠有效減少人工誤差。目前，該技術已被用于多種基質中藥物殘留的檢測[28-30]。安永生等[31]采用Online-SPE-HPLC-MS 測定水中阿特拉津，進樣量為2.5 mL 時，檢出限為8 ng/L，實際水樣加標回收率為91.6%～101.0%。陳永艷等[32]使用Online-SPE-HPLC-MS/MS 測定水源水和飲用水中典型農藥及代謝產物，方法檢出限為0.03～1.5 ng/L， 但107 種農藥中僅含5 種TPs。

本研究結合Online SPE 方便快捷和LC-MS/MS 靈敏度高、分析速率快的優勢，從SPE 柱選擇、質譜條件和液相色譜條件3 個方面對方法進行優化，建立了在線固相萃取-超高效液相色譜-串聯質譜（Online SPE-UPLC-MS/MS）同時測定水中15 種TPs 的方法。應用本方法對北京溫榆河地表水3 個點位的15 種TPs 進行測定，以考察TPs 在北京市地表水河流中的殘留水平。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

2777C-FLR 在線固相萃取-ACQUITYQSM-BSM 超高效液相色譜儀-Xevo T-QS 三重四極桿串聯質譜（美國沃特世公司）；Oasis HLB Direct Connect 在線固相萃取柱（20 mm × 2.1 mm， 5 μm， 美國沃特世公司）；ACQUITYUPLC?BEH C18反相色譜柱（50 mm × 2.1 mm， 1.7 μm， 美國沃特世公司）；Milli-Q 超純水儀（美國Millipore 公司）。0.22 μm 聚醚砜水相針式濾頭（美國沃特世公司）。

乙腈、甲醇和甲酸（色譜純，美國Fisher Scientific 公司）。15 種TPs 標準品購自美國Sigma-Aldrich公司，詳細信息見表1。標準品用甲醇溶解，配制成1000 mg/L 的單標標準儲備液，于-20 ℃保存備用；將上述15 種TPs 單標用超純水稀釋，配制成各TPs 濃度均為10 mg/L 的混合標準溶液。

表1 15種三嗪類農藥（TPs）的物理化學性質Table 1 Physical and chemical properties of triazine pesticides (TPs)

1.2 樣品采集及前處理

采集北京市溫榆河地表水水樣，置于洗凈的棕色試劑瓶中，于4 ℃保存。水樣加入適量的內標標準液（Atrazine-d5，100 μg/L）， 經0.22 μm 針式濾頭過濾后，待測。

1.3 Online SPE-UPLC-MS/MS分析參數

Online SPE 條件 使用Online SPE 模式進樣，進樣體積為1000 μL， 全自動Online SPE 裝置配有兩根Online SPE 柱，交替使用。在0～3.8 min 時，四元泵完成樣品從自動進樣器到Online SPE 柱的富集；4.1 min 時，六通閥切換至分析流路中；4.1～11.0 min 二元泵將富集在Online 萃取柱進行沖洗和活化，Online SPE 裝置流路示意圖見圖1。

UPLC 測定條件 柱溫箱溫度40 ℃；流動相：四元泵用于富集樣品，四元泵流動相A 為純水，B 為乙腈，C 為甲醇。四元泵梯度洗脫程序：0～0.5 min，100% A；0.5～3.8 min，100% A；3.8～4.1 min，100%C；4.1～8.0 min，100% C；8.0～8.1 min，50% A，50% B；8.1～12.0 min，100% A。二元泵用于色譜分析，二元泵流動相A 為乙腈，流動相B 為0.5%甲酸（含10 mmol/L 的醋酸銨）。二元泵洗脫程序：0.0～3.8 min，20% A；3.8～4.1 min，20% A；4.1～5.0 min，20%～50% A；5.0～10.0 min，55% A；10.0～10.1 min，50%～98% A；10.1～12.0 min，98% A；12.0～12.1 min，98%～20% A；12.1～13.0 min，20% A。

MS/MS 檢測條件 毛細管電壓設定為2.15 kV， 離子源溫度為150 ℃，去溶劑化溫度為400 ℃，脫溶劑氣流量為1000 L/h。采用正離子多反應監測模式（MRM）記錄色譜圖。使用氮氣作為去溶劑化和霧化氣體，碰撞氣為氬氣。

2 結果與討論

2.1 檢測方法的優化

2.1.1 質譜條件的優化

配制濃度為100 μg/L 的15 種TPs 的單一標準溶液，采用電噴霧正離子模式（ESI+），以準分子離子為母離子，分別對15 種單標溶液進行二級質譜掃描，利用沃特世公司軟件的自動調諧功能對子離子質荷比、錐孔電壓和毛細管電壓等參數進行自動優化，選擇豐度較高的兩個碎片離子作為定量離子和定性離子。優化后的質譜參數見表2。

表2 15種TPs的質譜分析條件Table 2 Mass spectrometry conditions for 15 kinds of TPs

2.1.2 液相色譜分析條件優化

十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18）類色譜柱是目前最常用的液相色譜分離柱，劉彬等[33]比較了TPs 在ZORBAX Eclipse Plus C18柱和SB-C18柱（后者具有二異丁基側鏈基團，耐酸性更強）上的分離情況，發現ZORBAX Eclipse Plus C18柱無法分離西草凈、阿特拉津、撲滅津和莠滅凈，SB-C18柱無法分離阿特拉津和去草凈，但兩種色譜柱都可實現定量分析，其中，SB-C18柱分離時間略長于ZORBAX Eclipse Plus C18。吳春英等[34]利用ACQUITYUPLC?BEH C18反相色譜柱實現了27 種TPs 的完全分離，并且分離的峰形尖銳對稱。因此，本研究選用ACQUITYUPLC?BEH C18反相色譜柱，以獲得較好的色譜保留和色譜峰形。

使用15 種TPs 混合標準溶液，在Open Architecture（OA）模式下，對比了乙腈-0.1%（體積分數，下同）甲酸、甲醇-0.1%甲酸、乙腈-0.5%甲酸、甲醇-0.5%甲酸、乙腈-0.5%甲酸（含10 mmol/L 醋酸銨）和甲醇-0.5%甲酸（含10 mmol/L 醋酸銨）6 種流動相條件下15 種TPs 的信號強度，結果表明，流動相為乙腈-0.5%甲酸（含10 mmol/L 醋酸銨）時，15 種TPs 的信號強度最好。

2.1.3 Online SPE條件優化

SPE 柱的填料種類對目標化合物的富集有決定性影響。目前，TPs 進行大體積離線富集時多采用HLB[34-35]和C18[36]SPE 柱，因此，本研究選用XBridge C18和Oasis HLB 這兩種通用型SPE 柱進行對比。優化液相色譜梯度洗脫條件后，使用這兩種SPE 柱對目標分析物進行富集，結果表明，使用Oasis HLB 柱時，極性較強的目標化合物（如撲滅通和撲滅津）的色譜響應值更高。因此，本研究選用Oasis HLBSPE 柱進行在線富集。

利用15 種TPs 的混合標準溶液，洗脫溶劑為純甲醇，對比了純水和不同濃度甲酸溶液作為上樣溶劑時，各目標化合物的響應強度。如圖2 所示，純水作為上樣溶劑時，除西草凈外，其它14 種TPs 的富集效果較好；0.5%甲酸作為上樣溶劑時，西草凈的富集效果最好，而其它14 種TPs 的富集效果略差。綜合考慮，本研究選取純水作為上樣溶劑。

圖2 15 種TPs 在不同上樣和洗脫體系中的響應：（A）上樣溶劑為超純水，洗脫溶劑為乙腈；（B）上樣溶劑為超純水，洗脫溶劑為甲醇；（C）上樣溶劑為0.1%甲酸，洗脫溶劑為甲醇；（D）上樣溶劑為0.5%甲酸，洗脫溶劑為甲醇。Fig.2 Responses of 15 kinds of TPs in different loading and elution systems:(A)Sample loading with ultra-pure water and eluted with acetonitrile; (B) Sample loading with ultra-pure water and eluted with methanol;(C)Sample loading with 0.1%formic acid water and eluted with methanol;(D)Sample loading with 0.5%formic acid water and eluted with methanol.

利用15 種TPs 的混合標準溶液，上樣溶劑為純水，對比了100%乙腈和100%甲醇作為洗脫溶劑時，各目標化合物的響應強度。如圖2 所示，上樣溶劑為純水、洗脫溶劑為純甲醇時，15 種TPs 的信號強度最好。不同上樣和洗脫體系下15 種TPs 的響應結果見圖2，15 種TPs 的色譜圖見圖3（序號對應的化合物同表1）。

圖3 15 種TPs 的色譜圖，上樣濃度為1 ng/L，上樣溶劑為超純水，洗脫溶劑為甲醇，流動相為乙腈-0.5%甲酸（含10 mmol/L 醋酸銨）Fig.3 Chromatograms of 15 kinds of TPs at concentration level of 1 ng/L. Sample is loaded with ultra-pure water and eluted with methanol. Mobile phase is acetonitrile-0.5% formic acid water (containing 10 mmol/L ammonium acetate)

2.2 方法的分析性能

2.2.1 線性關系和檢出限

配制1～100 ng/L 系列15 種TPs 的混合標準溶液，采用優化的色譜條件進行檢測，以峰面積對質量濃度做線性回歸，15 種TPs 在各自濃度范圍內具有良好的線性關系（R2＞0.994）。采用空白基質提取液逐級稀釋標準溶液的方法，確定檢出限和定量限，結果見表3。15 種TPs 的檢出限（LOD，S/N=3）為0.001～0.036 ng/L， 定量限（LOQ，S/N=10）為0.003～0.108 ng/L。

表3 15種TPs的線性方程、線性相關系數、檢出限及定量限Table 3 Linear equations, linear correlation coefficients, limits of detection (LODs) and limits of quantification (LOQs) of 15 kinds of TPs

2.2.2 回收率和精密度

在陰性水樣（超純水）中加入混合標準溶液，加標水平分別為10、20 和50 ng/L， 水樣經過0.22 μm聚醚砜水相針式濾頭過濾后測定，計算樣品的加標回收率。由圖4 可知，超純水水樣中15 種TPs 的加標回收率在69.7%～103.0%之間，RSD 在3.13%～9.98%之間，。

圖4 15 種TPs 的加標回收率和精密度Fig.4 Spiking recoveries and precisions of 15 kinds of TPs (n=6)

2.2.3 實際樣品分析

采用上述方法測定北京市溫榆河3 個地點的地表水樣品中15 種TPs 的殘留量（WY1～WY3，采集時間為2021 年11 月6 日），以驗證方法的實用性。樣品采集后，加入適量內標，采用0.22 μm 聚醚砜水相針式濾頭過濾后，采用建立的Online SPE-UPLC-MS/MS 進行測定，結果見圖5。3 個水樣中，WY1 和WY3中15 種TPs 均有檢出， WY2 中僅苯嗪草酮未檢出， TPs 的總檢出濃度分別為64.49、71.35 和97.41 ng/L。根據《水環境質量標準》（GB 3838—2002）[18]中集中式生活飲用水特定項目標準限值規定，TPs 中阿特拉津的濃度不得超過0.003 mg/L， 本次檢測的所有樣品均未超標。樣品中去異丙基阿特拉津、滅蠅胺和撲草凈的環境濃度較高，溫榆河兩岸有大量農田和城市園林綠化帶[37]，農業耕作[38]使用的除草劑可能是溫榆河河水中TPs 的直接和主要來源。

圖5 溫榆河河水中TPs 濃度的分布圖Fig.5 Distribution of TPs concentration in the Wenyu River water

3 結論

采用Online SPE 富集凈化方法，結合UPLC-MS/MS 法實現了地表水中15 種TPs 殘留的同時測定，樣品經0.22 μm 針式濾頭過濾后即可進樣分析。本方法15 種TPs 的線性關系良好（R2＞0.994），檢出限在0.001～0.036 ng/L 之間，定量限為0.036～0.108 ng/L。與常規TPs 檢測方法相比，本方法具有分析通量高、檢出限低、精確度高、檢測時間短和分析效率高等特點，適用于地表水中痕量TPs 的快速測定。