光敏四面體框架核酸用于活細(xì)胞內(nèi)mRNA的檢測(cè)

黃書(shū)娟 徐燕 方小軍 路東亮 謝永榮 林美華

1（贛南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院， 贛州 341000） 2（贛南師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院， 贛州 341000）

3（中國(guó)地質(zhì)大學(xué)（武漢）材料與化學(xué)學(xué)院， 納米礦物材料及應(yīng)用教育部工程研究中心， 430074）

作為一類(lèi)新型三維DNA 納米結(jié)構(gòu)，四面體框架核酸（Tetrahedral framework nucleic acids，tFNAs）是由4 條等物質(zhì)量單鏈DNA退火形成[1]，具有精確可控、尺寸可調(diào)、易修飾、合成產(chǎn)率高以及結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于各種靶標(biāo)分子檢測(cè)[2-7]和生物成像[8-11]。研究表明，四面體框架核酸是通過(guò)角攻擊姿態(tài)接觸細(xì)胞膜[12]，無(wú)需轉(zhuǎn)染試劑輔助，即可被細(xì)胞高效攝取。因此，四面體框架核酸常用于細(xì)胞內(nèi)多種靶標(biāo)分子的檢測(cè)[13-16]。

細(xì)胞內(nèi)腫瘤相關(guān)信使RNA（Messenger RNA，mRNA）的表達(dá)水平與腫瘤進(jìn)展和預(yù)后相關(guān)[17]，對(duì)其精確檢測(cè)和成像有利于疾病的早期診斷[18]。迄今，研究者利用DNA 的可編程性，基于四面體框架核酸設(shè)計(jì)了分子信標(biāo)[19-20]、Toehold 介導(dǎo)鏈取代[21]、納米鑷子結(jié)構(gòu)[15]、可變形結(jié)構(gòu)[22]、分子內(nèi)催化發(fā)夾組裝[23]和熵驅(qū)動(dòng)DNA 放大器[24]等結(jié)構(gòu)用于活細(xì)胞內(nèi)mRNA 的成像。四面體框架核酸一般需要數(shù)個(gè)小時(shí)才能進(jìn)入細(xì)胞，而進(jìn)入細(xì)胞后且遇到靶標(biāo)mRNA將立即與之發(fā)生雜交反應(yīng)，并產(chǎn)生相應(yīng)的信號(hào)變化。傳統(tǒng)的四面體框架核酸探針一直處于“打開(kāi)”的狀態(tài)，在到達(dá)細(xì)胞內(nèi)特定位置前即可完成靶標(biāo)識(shí)別和響應(yīng)，難以控制反應(yīng)起點(diǎn)，不能實(shí)現(xiàn)在特定時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)活細(xì)胞內(nèi)mRNA 分布，而mRNA 的表達(dá)水平和空間分布具有很高的時(shí)空依賴(lài)性[18,25]。因此，發(fā)展一種可在任意時(shí)間點(diǎn)對(duì)細(xì)胞內(nèi)靶標(biāo)mRNA 檢測(cè)的框架核酸具有重要意義。

光是一種理想的外部刺激因子，對(duì)大部分細(xì)胞損傷小，并且可通過(guò)時(shí)間和空間進(jìn)行程序性控制[26]。因此，光常被用于調(diào)控細(xì)胞內(nèi)核酸活性，如基因表達(dá)[27]、DNA 邏輯門(mén)[28]、DNA 雜交[29]和DNA 酶活性[30]等。得益于DNA合成技術(shù)的發(fā)展，將光響應(yīng)分子嵌入DNA 中，使DNA 探針的檢測(cè)功能處于“關(guān)閉”狀態(tài)；在光照下，光響應(yīng)分子發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，將探針“激活”，發(fā)揮其檢測(cè)功能[31]。因此，這種光化學(xué)方法有助于時(shí)空可控的生物分子原位分析。Qiu 等[32]將光敏分子嵌入分子信標(biāo)中，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞內(nèi)mRNA 的時(shí)空可控檢測(cè)。Chu 等[33]利用上轉(zhuǎn)換納米粒子作為載體將光響應(yīng)分子信標(biāo)運(yùn)送至細(xì)胞內(nèi)，近紅外光照下激活探針，定點(diǎn)檢測(cè)靶標(biāo)mRNA。Huang[25]和Lin[34]等構(gòu)建了多種光響應(yīng)的核酸探針，實(shí)現(xiàn)了單細(xì)胞水平mRNA 的高時(shí)空分辨檢測(cè)。

本研究將光響應(yīng)分子2-硝基芐基嵌入四面體框架核酸內(nèi)，構(gòu)建了一種紫外光照遠(yuǎn)程操控的新型光敏探針，用于任意時(shí)間點(diǎn)活細(xì)胞內(nèi)靶標(biāo)mRNA 分布的檢測(cè)。溶液中存在靶標(biāo)時(shí)，探針熒光強(qiáng)度可由光照時(shí)間程序性控制。光敏四面體框架核酸在溶液中能檢測(cè)濃度低至約1 nmol/L 的靶標(biāo)DNA，并可在紫外光照下實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)起點(diǎn)可控的mRNA 檢測(cè)。本研究構(gòu)建的光敏四面體框架核酸在活細(xì)胞內(nèi)mRNA的高時(shí)空分辨監(jiān)測(cè)方面具有巨大的應(yīng)用潛力。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

LUYOR-365L 型紫外手電筒（美國(guó)路陽(yáng)中國(guó)公司）；UV-2600 紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津公司）；PTC-200 型PCR 儀（美國(guó)MJ Research 公司）；凝膠電泳成像儀（美國(guó)Bio-Rad 公司）；FS5 熒光分光光度計(jì)（英國(guó)愛(ài)丁堡公司）；SP8 激光共聚焦熒光顯微鏡（德國(guó)萊卡公司）。

磷酸鹽緩沖液（PBS，0.2 mol/L， 中國(guó)上海生工生物工程公司）；5 × TBE 緩沖液（tris-硼酸，EDTA，上海生工生物工程公司）；胎牛血清和DMEM 培養(yǎng)基（Gibco 公司）；人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7（上海細(xì)胞庫(kù)）。所用DNA 序列如表1 所示，均采用高效液相法純化（上海生工生物工程公司）。

表1 本研究中使用的DNA序列Table 1 DNA sequences used in this work

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 光敏四面體框架核酸的合成

將單鏈DNA 溶解，用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)量260 nm 處吸收值，計(jì)算濃度，并稀釋至100 μmol/L。根據(jù)文獻(xiàn)[4]，將形成四面體結(jié)構(gòu)的4 條單鏈S1～S4 與光響應(yīng)莖環(huán)結(jié)構(gòu)PC-LOOP 在10 mmol/L PBS 溶液中等比例混合，配制成終濃度為1 μmol/L 的溶液，將其放入PCR 儀中，95 ℃加熱10 min，然后降溫至4 ℃并保持10 min 以上，即得到光敏四面體框架核酸結(jié)構(gòu)。

1.2.2 凝膠電泳表征

用1×TBE 緩沖液配制10%（m/V）聚丙烯酰胺凝膠。將制備好的光敏四面體框架核酸和四面體、雙鏈、單鏈DNA 形成的對(duì)照結(jié)構(gòu)加至凝膠上樣口，80 V 恒電壓電泳2 h。電泳結(jié)束后，凝膠在Gelred 染料中浸泡15 min， 然后置于凝膠成像儀中拍照。

1.2.3 光敏四面體框架核酸對(duì)紫外光的響應(yīng)

在10 nmol/L 靶標(biāo)DNA 存在下，50 nmol/L 光敏四面體框架核酸用365 nm 紫外光（光強(qiáng)密度7000 μW/cm2）照射30 s， 然后用熒光分光光度計(jì)動(dòng)力學(xué)模式監(jiān)測(cè)熒光變化2 min， 再用紫外光照射30 s，測(cè)定熒光強(qiáng)度變化，如此交替進(jìn)行7 次。此外，在560 nm 光激發(fā)下，用發(fā)射模式監(jiān)測(cè)不同光照時(shí)間下570～620 nm 的熒光強(qiáng)度。

1.2.4 溶液中不同濃度靶標(biāo)DNA的檢測(cè)

將50 nmol/L 光敏四面體框架核酸與不同濃度的靶標(biāo)DNA 混合，用365 nm 紫外光照射樣品3 min。樣品在室溫下反應(yīng)1 h 后，用發(fā)射模式檢測(cè)熒光強(qiáng)度。對(duì)于TAMRA 基團(tuán)，采用560 nm 光激發(fā)，發(fā)射范圍570～620 nm， 記錄峰位于585 nm 處的熒光強(qiáng)度。對(duì)于FAM 基團(tuán)，采用488 nm 光激發(fā)，發(fā)射范圍500～560 nm， 記錄520 nm 處的熒光強(qiáng)度。

1.2.5 光敏四面體框架核酸穩(wěn)定性測(cè)試

將1 μmol/L 光敏四面體框架核酸與等體積的含有10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基孵育不同時(shí)間，然后采用電泳表征納米結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。

1.2.6 細(xì)胞培養(yǎng)及激光共聚焦成像

將MCF-7 細(xì)胞在含有10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將細(xì)胞分散在一次性培養(yǎng)皿中，置于37 ℃含5%的CO2的培養(yǎng)箱中孵育12 h。細(xì)胞用PBS 緩沖液洗3 次，然后用含有10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基稀釋光敏四面體框架核酸（100 nmol/L），37 ℃孵育6 h。PBS 緩沖液洗3 次后，加入新鮮培養(yǎng)基，用激光共聚焦顯微鏡63×物鏡對(duì)細(xì)胞成像。用365 nm 紫外光照細(xì)胞3 min，然后將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中孵育30 min，采用激光共聚焦顯微鏡成像。對(duì)于TAMRA 基團(tuán)，采用561 nm 光激發(fā)，測(cè)量570～685 nm 的熒光光譜。對(duì)于FAM 基團(tuán)，采用488 nm 光激發(fā)，測(cè)量493～560 nm 的熒光光譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)原理

如圖1A 所示，光敏四面體框架核酸由四面體DNA 納米結(jié)構(gòu)與光響應(yīng)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)（PC-LOOP）雜交形成。其中，四面體的1 個(gè)頂點(diǎn)延伸出15 個(gè)堿基（與莖環(huán)結(jié)構(gòu)的延長(zhǎng)處互補(bǔ)），并在末端標(biāo)記淬滅基團(tuán)（BHQ2）；莖環(huán)結(jié)構(gòu)的莖與環(huán)之間以光響應(yīng)分子（2-硝基芐基，PC linker）連接，環(huán)與剩余的莖設(shè)計(jì)成靶標(biāo)序列的互補(bǔ)序列，并在末端標(biāo)記熒光基團(tuán)（TAMRA）。選擇與腫瘤增殖相關(guān)的MnSOD mRNA 為模型靶標(biāo)。四面體框架核酸與莖環(huán)結(jié)構(gòu)雜交形成光敏四面體框架核酸，熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)距離靠近，發(fā)生能量共振轉(zhuǎn)移，探針的熒光被淬滅。當(dāng)其進(jìn)入細(xì)胞后，在無(wú)紫外光輻照背光下，莖環(huán)結(jié)構(gòu)具有良好的熱力學(xué)穩(wěn)定性（ΔG=-30.12 kJ/mol，NUPACK 計(jì)算），光敏四面體框架核酸不能與靶標(biāo)mRNA 發(fā)生雜交反應(yīng)而處于“潛伏”狀態(tài)。如圖1B 所示，在紫外光照射下，硝基芐基接頭發(fā)生裂解（圖2），莖環(huán)結(jié)構(gòu)被破壞，形成具有Toehold 的DNA 雙鏈，與靶標(biāo)mRNA 發(fā)生Toehold 介導(dǎo)的鏈取代反應(yīng)。因此，通過(guò)紫外光照可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)mRNA 的檢測(cè)。

圖1 （A）光敏四面體框架核酸（tFNA）自組裝示意圖；（B）光敏tFNA 用于細(xì)胞內(nèi)mRNA 可控檢測(cè)原理圖Fig.1 (A) Illustration of the assembly of photoresponsive tetrahedral framework nucleic acids (tFNA);(B) Illustration of the photoresponsive tFNA for detection of mRNA in living cells with temporal control

圖2 （A）光敏莖環(huán)結(jié)構(gòu)在紫外光照下被破壞，暴露出立足點(diǎn)；（B）插在莖環(huán)中的光敏連接器結(jié)構(gòu)和光切反應(yīng)Fig.2 (A) Upon UV irradiation, the structure of stem-loop is destroyed, exposing the toehold; (B) Chemical structure and principle of photo cleavage of linker incorporated in stem-loop

2.2 光敏四面體框架核酸合成和表征

將5 條DNA 按照等物質(zhì)的量（等摩爾）混合，通過(guò)一步法退火合成了光敏四面體框架核酸（tFNA），并采用聚丙烯酰胺凝膠電泳表征。如圖3 所示，隨著DNA 鏈條數(shù)增加，形成結(jié)構(gòu)的泳動(dòng)速率逐漸降低，tFNA 在泳道的遷移速率最慢（Lane 6），說(shuō)明光敏四面體框架核酸合成成功，并且產(chǎn)率大于85%。

圖3 （A）光敏tFNA 的聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，泳道1 是20 bp 的DNA marker；（B）A 圖中泳道2～6中條帶強(qiáng)度和遷移位置的定量分析Fig.3 (A)Native polyacrylamide gel electrophoresis analysis of the assembly of photoresponsive tFNA,Lane 1 is 20 bp Marker; (B) Quantitative analyses of migration and intensity of each band in lanes 2-6 in Fig.3A

2.3 傳感器可行性驗(yàn)證

考察了光敏四面體框架核酸在溶液中對(duì)靶標(biāo)DNA 的響應(yīng)情況（圖4A）。當(dāng)溶液中只有光敏tFNA時(shí)，溶液的熒光較弱；加入靶標(biāo)DNA后溶液熒光無(wú)明顯增加，說(shuō)明莖環(huán)結(jié)構(gòu)的熱力學(xué)性能穩(wěn)定，無(wú)法與靶標(biāo)發(fā)生雜交反應(yīng)；用紫外光繼續(xù)照射溶液30 s 后，溶液的熒光增強(qiáng)為原來(lái)的2 倍以上（圖4B），說(shuō)明光敏四面體與靶標(biāo)DNA 雜交反應(yīng)可以通過(guò)紫外光照觸發(fā)。當(dāng)溶液中存在靶標(biāo)DNA 但無(wú)紫外光照時(shí)，即使反應(yīng)進(jìn)行1 h， 熒光變化率F/F0（F為任意時(shí)刻溶液的熒光，F(xiàn)0為溶液的初始熒光）穩(wěn)定在1 左右（圖4C），表明光敏tFNA 在無(wú)紫外光照下無(wú)法與靶標(biāo)結(jié)合。通過(guò)實(shí)時(shí)測(cè)定溶液熒光變化可以發(fā)現(xiàn)，在靶標(biāo)不存在條件下，紫外光照3 min，F(xiàn)/F0基本不變；加入10 nmol/L 靶標(biāo)DNA 并光照30 s 后，F(xiàn)/F0迅速增加（圖4D），即光敏tFNA 對(duì)靶標(biāo)響應(yīng)需要紫外光引發(fā)。光敏tFNA 溶液進(jìn)行紫外光照后，加入非特異性DNA，溶液的熒光無(wú)明顯變化，說(shuō)明光敏tFNA 對(duì)紫外光響應(yīng)具有靶標(biāo)特異性。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，此傳感器的檢測(cè)原理是可行的。

圖4 （A）溶液中光敏tFNA 檢測(cè)靶標(biāo)DNA 示意圖；（B）光敏tFNA 在不同條件下的熒光光譜曲線；（C）在靶標(biāo)存在和無(wú)紫外光照射下，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)光敏tFNA 熒光變化率（F/F0）的變化，內(nèi)插圖為與靶標(biāo)反應(yīng)1 h前后溶液的熒光光譜曲線；（D）實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)光敏tFNA 的F/F0 在不同條件下的變化；（E）在紫外光照射下，光敏tFNA 與非特異性DNA 反應(yīng)前后的熒光光譜曲線Fig.4 (A) Illustration of the photoresponsive tFNA for detection of the target DNA in buffer solution;(B) Representative fluorescence spectra of photoresponsive tFNA in different conditions; (C) Real-time monitoring of changes of fluorescence (F/F0) in the presence of target DNA but without UV irradiation, inset shows the representative fluorescence spectra of photoresponsive tFNA before and after incubation with target molecule for 1 h; (D) Real-time monitoring of changes of F/F0 in different conditions; (E) Representative fluorescence spectra of the photoresponsive tFNA before and after incubation with random DNA under UV irradiation

2.4 紫外光照時(shí)間的優(yōu)化

光敏四面體框架核酸對(duì)靶標(biāo)DNA 的響應(yīng)是由紫外光照引發(fā)的，光照強(qiáng)度對(duì)探針活性具有重要影響，靶標(biāo)DNA 存在時(shí)，固定紫外光強(qiáng)密度，控制光照時(shí)間，研究體系熒光變化。采用紫外光照射（固定30 s）和關(guān)、閉交替的方式，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)溶液的F/F0的變化。如圖5A 所示，隨著光照次數(shù)增加，F(xiàn)/F0先增大，當(dāng)?shù)? 次光照時(shí)，F(xiàn)/F0最大，之后保持穩(wěn)定。因此，可通過(guò)光照時(shí)間程序性控制光敏四面體框架核酸的活性。記錄不同的紫外光照時(shí)長(zhǎng)激發(fā)后體系的熒光光譜。如圖5B 所示，當(dāng)10 nmol/L 靶標(biāo)DNA 存在時(shí)，隨著紫外光照從5 s 延長(zhǎng)到200 s，熒光強(qiáng)度不斷增強(qiáng)，并在200 s 時(shí)達(dá)到飽和。此結(jié)果與實(shí)時(shí)熒光監(jiān)測(cè)的結(jié)果一致，表明光敏四面體框架核酸可被遠(yuǎn)程控制的光照強(qiáng)度程序性激活，并且光照3 min 即可在靶標(biāo)存在時(shí)使信號(hào)達(dá)到最大值。后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇紫外光照3 min，光密度7000 μW/cm2。

圖5 （A）靶標(biāo)DNA 存在時(shí)，通過(guò)精確控制紫外光打開(kāi)和關(guān)閉狀態(tài)，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)光敏tFNA 的F/F0 的變化；（B）靶標(biāo)DNA（10 nmol/L）存在時(shí)，不同光照時(shí)間的光敏tFNA 的熒光光譜Fig.5 (A) Real-time monitoring of the changes of F/F0 by precise control of UV irradiation state (on or off) in the presence of target DNA;(B)Representative fluorescence spectra of photoresponsive tFNA in the presence of target DNA (10 nmol/L) at different UV irradiation time

2.5 傳感器的分析性能

考察了光敏四面體框架核酸對(duì)溶液中模擬mRNA（即同序列的DNA）的檢測(cè)性能。如圖6A 所示，紫外光激活后，隨著靶標(biāo)DNA 濃度增加，熒光強(qiáng)度先逐漸增強(qiáng)后趨于穩(wěn)定。熒光峰（585 nm）強(qiáng)度與靶標(biāo)DNA 濃度的關(guān)系如圖6B 所示，檢測(cè)靶標(biāo)DNA 濃度的線性范圍為1.64～25 nmol/L，線性方程為F585=3007.9+521.7C（R2=0.992，n=3），檢出限為1.64 nmol/L（3σ）。與其它基于四面體DNA 納米結(jié)構(gòu)檢測(cè)DNA的方法相比[35]，光敏tFNA 具有更高的靈敏度。

圖6 （A）紫外光照射后，光敏tFNA 對(duì)溶液中不同濃度靶標(biāo)DNA 響應(yīng)的熒光光譜；（B）585 nm 處熒光強(qiáng)度與靶標(biāo)DNA 濃度的關(guān)系曲線，內(nèi)插圖為線性曲線；（C）紫外光照射后，光敏tFNA 對(duì)相同濃度的靶標(biāo)DNA（包括完全互補(bǔ)序列、單堿基錯(cuò)配和雙堿基錯(cuò)配序列）響應(yīng)的熒光曲線，未加靶標(biāo)DNA 的樣品作為對(duì)照組；（D）光敏tFNA 與培養(yǎng)基孵育不同時(shí)間的凝膠電泳圖，泳道1 為含有tFNA 的緩沖溶液，泳道2～8 分別為孵育0、1、2、4、12、24 和36 h 的tFNAFig.6 (A)Representative fluorescence spectra of photoresponsive tFNA responding to various concentrations of target DNA in buffer after UV irradiation;(B)Fluorescence intensity at 585 nm vs concentration of target DNA,the inset is the calibration cueve;(C)Representative fluorescence spectra of photoresponsive tFNA responding to the same concentration of various targets after UV irradiation, including perfect matched, single base mismatched, and two base mismatched targets, the group without target DNA is set as the control; (D) Native polyacrylamide gel electrophoresis analysis of the photoresponsive tFNA mixed with DMEM for different time.Lane 1 is tFNA in buffer, and lanes 2-8 correspond to different mixed time (0, 1, 2, 4, 12, 24 and 36 h),respectively

采用光激活的光敏tFNA 分別對(duì)完全互補(bǔ)配對(duì)（Perfect matched）、單堿基錯(cuò)配（Single base mismatched）和雙堿基錯(cuò)配（Two bases mismatched）DNA 序列進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，只有與完全互補(bǔ)配對(duì)的靶標(biāo)DNA反應(yīng)后，熒光才會(huì)明顯增強(qiáng)（圖6C），這說(shuō)明光敏tFNA 對(duì)靶標(biāo)識(shí)別具有良好的特異性。

探針在復(fù)雜環(huán)境的穩(wěn)定性是進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)的重要前提。將光敏tFNA 與等體積的含有10%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基孵育，并用凝膠電泳表征，考察不同孵育時(shí)間下的探針?lè)€(wěn)定性。如圖6D 所示，隨著孵育時(shí)間延長(zhǎng)，四面體框架核酸依然能保持穩(wěn)定，即使孵育36 h，也僅有非常少量的四面體框架核酸發(fā)生降解。這表明在培養(yǎng)基中，光敏tFNA 結(jié)構(gòu)可保持穩(wěn)定至少36 h， 可用于細(xì)胞內(nèi)mRNA 的檢測(cè)。

2.6 活細(xì)胞內(nèi)mRNA的光控檢測(cè)

光敏四面體框架核酸與乳腺癌（MCF-7）細(xì)胞孵育6 h 后，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察明場(chǎng)成像和561 nm 發(fā)射波長(zhǎng)下的熒光成像。如圖7A-a 所示，TAMRA通道未出現(xiàn)熒光。采用紫外光照射3 min，再將細(xì)胞孵育0.5 h 后，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)明顯的TAMRA 紅色熒光信號(hào)（圖7A-b）。本實(shí)驗(yàn)條件下的紫外光照對(duì)細(xì)胞活性無(wú)明顯影響（圖7B）。飛秒雙光子激光可以提供更好的三維空間定位，增加成像深度[25]，在時(shí)間和空間上控制光敏tFNA 的激活。利用雙光子激光（740 nm）照射指定的細(xì)胞，可在單細(xì)胞水平上選擇性地激活指定細(xì)胞（圖7A-c）。這說(shuō)明光敏tFNA 無(wú)需轉(zhuǎn)染試劑即可進(jìn)入細(xì)胞，并且只有在紫外光下才能激活探針，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)mRNA 時(shí)空可控的檢測(cè)。

圖7 （A） MCF-7 細(xì)胞與光敏tFNA 孵育的激光共聚焦顯微鏡圖：TAMRA通道、與明場(chǎng)疊加通道分別在（a）無(wú)紫外光照、（b）紫外光照射和（c）雙光子激光選擇性紫外光照條件下的共聚焦圖，標(biāo)尺為20 μm；（B） MTT 法檢測(cè)不同條件下MCF-7 細(xì)胞的活性：?jiǎn)为?dú)培養(yǎng)基、加3 min 紫外光照、培養(yǎng)基加光敏tFNA、培養(yǎng)基加光敏tFNA 及3 min 紫外光照Fig.7 (A)Confocal laser microscopy images of MCF-7 cells incubated with the photoresponsive tFNA,images of the TAMRA channel and the overlap under the conditions of (a) without UV irradiation, (b) with UV irradiation,and(c)selectively activated by two-photon laser,scale bar is 20 μm;(B)MTT assays of MCF-7 cells treated with the culture medium,3 min of UV irradiation photoresponsive tFNA and photoresponsive tFNA with UV irradiation, respectively

2.7 傳感器的普適性

基于DNA 精準(zhǔn)的堿基互補(bǔ)配對(duì)方式，設(shè)計(jì)了針對(duì)另一個(gè)靶標(biāo)mRNA（GAPDH）的光敏tFNA，分別用FAM 和Dabcly 標(biāo)記莖環(huán)結(jié)構(gòu)和四面體結(jié)構(gòu)，驗(yàn)證本傳感器的普適性。在靶標(biāo)DNA 存在和紫外光照下，光敏tFNA 的熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)（圖8A）。熒光動(dòng)力學(xué)監(jiān)測(cè)結(jié)果表明，靶標(biāo)不存在時(shí)，紫外光照3 min，熒光無(wú)明顯增加；加入靶標(biāo)DNA后，熒光增強(qiáng)約1 倍（圖8B）。這說(shuō)明針對(duì)GAPDH mRNA 的光敏tFNA 與靶標(biāo)發(fā)生雜交反應(yīng)受紫外光調(diào)控，與前面檢測(cè)MnSOD mRNA 的探針一致。檢測(cè)了溶液中不同濃度靶標(biāo)DNA 的熒光強(qiáng)度，在紫外光激活下，體系熒光強(qiáng)度隨著靶標(biāo)濃度的增加而增強(qiáng)（圖9A），GAPDH DNA 的檢出限為1.41 nmol/L（3σ）（圖9B），與前面光敏tFNA 對(duì)mRNA 的檢測(cè)結(jié)果相符，說(shuō)明光敏tFNA 傳感器具有較高靈敏度。

圖8 （A）光敏tFNA 在紫外光照和靶標(biāo)DNA 存在下的熒光增強(qiáng)；（B）實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)光敏tFNA 的F/F0 在不同條件下的變化Fig.8 (A) Upon UV irradiation, the enhancement of fluorescence intensity of photoresponsive tFNA in the presence of target DNA; (B) Real-time monitoring of the changes of F/F0 under different conditions

圖9 光敏tFNA 傳感器普適性驗(yàn)證:（A）紫外光照射后，光敏tFNA 對(duì)溶液中不同濃度靶標(biāo)DNA（GAPDH）響應(yīng)的熒光光譜曲線；（B）520 nm 處熒光強(qiáng)度與靶標(biāo)DNA 濃度的校正曲線，內(nèi)插圖是靶標(biāo)DNA 濃度在0～30 nmol/L 范圍內(nèi)與熒光強(qiáng)度的線性曲線；FAM 通道、與明場(chǎng)疊加通道分別在（C）無(wú)紫外光照和（D）紫外光照條件下的共聚焦圖;（E）TAMRA通道、FAM 通道、與明場(chǎng)疊加通道在紫外光照條件下的共聚焦圖，標(biāo)尺為20 μmFig.9 Verification of the generality of the proposed sensor: (A) Representative fluorescence spectra of photoresponsive tFNA responding to various concentrations of target DNA (GAPDH) in buffer after UV irradiation;(B)Corresponding calibration plot of the fluorescence intensity at 520 nm vs concentration of target DNA,the inset indicates the linear fitting for different target concentrations from 0 to 30 nmol/L;Images of FAM channel and the overlap(C)without UV irradiation,and(D)with UV irradiation;(E)Images of TAMRA channel,FAM channel and the overlap under the condition of UV irradiation. Scale bar is 20 μm

將此光敏tFNA 用于檢測(cè)活細(xì)胞內(nèi)靶標(biāo)GAPDH mRNA。如圖9C 所示，F(xiàn)AM 通道未出現(xiàn)明顯熒光。采用紫外光照射細(xì)胞3 min，再孵育0.5 h，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)明顯的FAM 綠色熒光信號(hào)（圖9D）。將MnSOD 和GAPDH mRNA 的兩種光敏tFNA 等比例混合，并與MCF-7 孵育，經(jīng)紫外光激活后，再將細(xì)胞孵育0.5 h，用共聚焦顯微鏡成像。如圖9E 所示，兩個(gè)通道都出現(xiàn)熒光信號(hào)，說(shuō)明光敏tFNA 可用于細(xì)胞內(nèi)兩種mRNA 的同時(shí)檢測(cè)，這證明了光敏tFNA 對(duì)細(xì)胞內(nèi)mRNA 的可控檢測(cè)具有普適性。

3 結(jié)論

構(gòu)建了一種光響應(yīng)的四面體框架核酸探針，此探針具有四面體框架核酸的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性以及免轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)入細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)，還具有光敏分子遠(yuǎn)程時(shí)空可控激活的優(yōu)點(diǎn)。通過(guò)遠(yuǎn)程紫外光照可以程序性激活四面體框架核酸的活性，控制識(shí)別靶標(biāo)的起始時(shí)間；在最佳光照條件下，探針可在溶液中檢出低至1 nmol/L的靶標(biāo)DNA。光敏tFNA 檢測(cè)活細(xì)胞內(nèi)靶標(biāo)mRNA 可由光照控制，具有高時(shí)空可控性以及檢測(cè)任意時(shí)間點(diǎn)mRNA 分布的潛力，為研究mRNA 的轉(zhuǎn)錄和降解等行為提供了新方法。