裂解多糖單加氧酶活性檢測方法的研究進展

沈潔如 王素英 張宏宇 婁婷婷 喬晨曦

1（天津商業大學生物技術與食品科學學院， 天津市食品生物技術重點實驗室， 天津 300134）

2（天津海關動植物與食品檢測中心， 天津 300461）

纖維素和幾丁質是自然界中儲量居第一位和第二位的生物質資源，分別以葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）為單體，通過β-1,4 糖苷鍵連接而成的直鏈高聚物[1-3]。一直以來，這類結晶態多糖的降解和利用是實驗室和工業領域研究的熱點和難點[4-6]。因纖維素和幾丁質的分子內部及分子間存在氫鍵，可形成高度有序的結晶態結構，限制了糖苷水解酶的可及性[7-8]，阻礙多糖結晶區域的有效降解[9]。然而，具有氧化裂解纖維素和幾丁質等結晶區域特性的裂解多糖單加氧酶（Lytic polysaccharide monooxygenases，LPMOs）的發現，為頑固多糖降解提供了新的方向[10-14]，在生物質轉化和生物燃料工業等方面具有廣闊的應用前景[15-16]。

在碳水化合物活性酶數據庫（www.cazy.org）中，LPMOs 歸為輔助活性家族（Auxiliary activity family，AA），目前已有AA9～11 和AA13～16 共7 個家族，其中，AA9 和AA10 家族的LPMOs 研究比較深入[17-20]。AA9 家族的LPMOs 主要源于真菌，作用于纖維素[21-22]、可溶性纖維寡糖[23]、木聚糖[24]、半纖維素[25]和淀粉[26]等底物。AA10 家族的LPMOs 主要源于細菌，具有纖維素、幾丁質、木聚糖以及甘露聚糖降解活性[10,14,27-28]。為探索各家族LPMOs 的酶學特性及其催化機理，對LPMOs 活性的檢測至關重要。目前，LPMOs 活性的檢測方法逐漸多樣化，主要包括色譜-質譜法、比色法和熒光探針標記法等。其中，色譜-質譜法因其靈敏度高、可對反應產物進行定性和定量分析等特點，為解析LPMOs 催化機制提供了重要手段[21,29-31]；比色法通過測定底物或產物的濃度，與酶活力建立量效關系，進而表征LPMOs 活性，常應用于突變體的快速高通量篩選[3]；熒光探針標記法利用熒光探針對多糖底物進行標記，通過測定熒光值表征LPMOs 活性[32]。以上方法雖存在一定的局限性，但都有其適用范圍，而各方法的有機結合可為LPMOs 的新酶開發、催化機制研究及酶工程中突變體的快速篩選等提供有力的技術支撐，從而實現LPMOs 在工業化生物質轉化中的應用。

有關LPMOs 活性檢測的綜述報道有許多[3-4,33]，但重點集中在LPMOs 結構、催化機制、家族分類和底物特異性等方面的總結與評述，對檢測方法的論述較少。本文評述了近5 年LPMOs 活性檢測方法的研究進展，重點對色譜-質譜聯用法、比色法和熒光探針標記法等的基本原理及其在LPMOs 活性檢測中的應用進行了梳理，總結了LPMOs 活性檢測方法的優缺點及適用范圍，并對其未來發展趨勢進行了展望。

1 基于色譜-質譜聯用法檢測LPMOs氧化產物

色譜-質譜聯用法是基于樣品的保留時間、碎片離子和峰面積分析其種類并計算含量，從而達到測定酶活力的目的[34]。不同催化活性的LPMOs 借助O2（或H2O2）和電子，從多糖鏈C1 或C4 位置獲取氫原子使之羥基化，導致糖苷鍵斷裂和多糖鏈端氧化[23,35]，產生不同類型的氧化產物。如具有纖維素活性的LPMOs 可以催化C1 或C4 位，也可以同時氧化二者[32,36]產生C1 位的醛糖酸和C4 位的4-醛基酮糖[3,10,22]，幾丁質活性的LPMOs 氧化C1 位生成醛糖酸內酯，并水合形成醛糖酸[10,36-37]（圖1）。對不同類型的產物進行識別和量化所用的色譜-質譜法不同。目前，常用于檢測LPMOs 活性的色譜-質譜聯用法主要包括高效陰離子交換色譜-脈沖電流檢測法（High-performance anion-exchange chromatography-pulsed amperometric detector，HPAEC-PAD）、親水作用液相色譜-質譜法（Hydrophilic interaction liquid chromatography-mass spectrometry，HILIC-MS）、多孔石墨化碳色譜-質譜法（Porous graphitized carbon chromatography-mass spectrometry，PGC-MS）和超高效液相色譜-質譜法（Ultra high performance liquid chromatography-mass spectrometry，UHPLC-MS）等，各檢測方法可測定產物的分子量范圍及優缺點見表1。

表1 色譜-質譜聯用法在LPMOs活性檢測中的應用Table1 Application of chromatography-mass spectrometry in detection of LPMOs activities

圖1 裂解多糖單加氧酶（LPMOs）氧化裂解纖維素和幾丁質的機理及其產物的形成：（A）LPMOs 催化機理[30]; （B）纖維素氧化裂解產物[32]; （C）幾丁質氧化裂解產物[10,37]Fig.1 Mechanism of oxidative cracking of cellulose and chitin by lytic polysaccharide monooxygenases(LPMOs) and the products: (A) Catalytic mechanism of LPMOs[30]; (B) Products of cellulose oxidated[32];(C) Products of chitin oxidated[10,37]

1.1 HPAEC-PAD方法

HPAEC 主要用于纖維素氧化產物糖醛酸的分析[10,29]，其中，在檢測低聚合度產物時PAD 的靈敏度高于CAD[29]。通過HPAEC-PAD 分離纖維素降解產物，最先被分離出的是非氧化產物，其次是C1 和C4 氧化產物，最后是C1/C4 雙氧化產物[46]（圖2）。在堿性條件下，C1 氧化產物因帶負電而被分離和檢測[40]。Westereng 等[40]通過HPAEC-PAD 耦合ESI-MS 檢測了ScLPMO10C 的C1 氧化產物，由于C4 氧化產物在堿性條件下易發生化學修飾和互變異構[23,47]，使質譜無法檢測到相應的分子質量。在可溶性產物的檢測中，HPAEC-PAD 測定氧化寡糖的檢出限（Limit of detection，LOD）可達0.09～0.40 ng/injection，寡糖的LOD 值為0.34～0.66 ng/injection[29]。因檢測不溶性產物存在局限性，使測得的LPMOs 整體活性低于真實值[3]。Cannella 等[48]通過水解酶處理LPMOs 催化反應后的產物，測定葡萄糖和葡糖酸的含量，并計算被氧化纖維素的總量，間接測定不溶性產物的含量。Frommhagen 等[24]采用相同的方法測定不溶物含量，得出在反應初期不溶性物所含的氧化寡糖的量高于可溶性部分。然而，通過此方式水解不溶性產物再進行分析時，耗時較長且標準品不易獲得，影響LPMOs 活性檢測的準確性。因此，該方法僅限于可溶性產物的分析。

圖2 不同來源的LPMOs 作用于纖維素的氧化裂解產物[46]Fig.2 Oxidative cracking products of cellulose by LPMOs from different sources[46]

1.2 HILIC-MS方法

HILIC 常作為中性寡糖的分析方法，如幾丁質降解產物[29,49]。Vaaje-Kolstad 等[10]通過HILIC 和MALDI-TOF-MS 聯用分析了源于粘質沙雷氏菌（Serratia marcescens）的CBP21 催化幾丁質的反應產物殼寡糖，并解析了CBP21 的催化機理。依據殼寡糖與幾丁-醛酸pH 值的不同，前者在中性流動相（乙腈-水）中保持穩定，后者因帶電荷，可通過增加離子強度調節洗脫液的pH 值實現殼寡糖和幾丁-醛酸的分離[50]。Westereng 等[29]通過堿性條件電離醛酸以及高強度離子洗脫液平衡電荷消除互斥效應，并在70%乙腈條件下，用HILIC 法檢測氧化寡糖的LOD 值范圍為33～113 ng/injection。由于PAD 的準確性易受乙腈影響，因此CAD 常與HILIC-MS 結合檢測。然而，該方法在分析聚合度大于4 的寡糖和氧化寡糖時，其解析效果較差[29]，可通過升高柱溫來提高HILIC 色譜的分離效果以及改善峰形，并且能防止寡糖發生異構分離現象。

1.3 PGC-MS方法

鑒于上述C4 氧化產物檢測的局限性，Westereng 等[40]結合HILIC（WAX 柱）和PGC 分離出C1 和C4氧化產物，根據樣品的極性特征，利用石墨色譜柱實現了纖維寡糖和氧化寡糖的分離[51]。因醛糖酸和非氧化產物的電離常數（pKa）值不同，在PGC 色譜分離過程中，弱堿性條件（pH 8）的流動相使醛糖酸帶負電（纖維二糖酸pKa=3.51[40]和D-葡萄糖酸pKa=3.7）[3,29]。基于此，Westereng 等[29]成功獲得了醛糖酸的分離條件以及相同聚合度的裂解產物的分離，如4-乙二醇醛糖和醛糖酸。對有相同保留時間的非氧化產物、C4 纖維糊精或醛酸及雙氧化產物，可通過質譜分析或者β-葡萄糖苷酶水解產物再次檢測[40]。PGC-MS 和CAD 可直接兼容，并在低離子濃度的洗脫液下對C4-纖維寡糖進行定量分析，其LOD 可低至45～66 ng/injection，滿足動力學研究的要求[40]。然而，該方法存在一定的局限性，由于PGC 固定相對長鏈寡糖有強親和力，即使在高洗脫強度下，聚合度＞5 的中性纖維低聚糖也不能被洗脫[29]，因此PGC 色譜只能分析聚合度≤5 的寡糖。

1.4 UHPLC-MS方法

Silva 等[31]將UHPLC（HILIC 柱）與ESI-MS 聯用檢測聚合度為1～5 的寡糖，結合基質輔助激光解析電離飛行時間質譜（MALDI-TOF MS）進一步分析了聚合度在3～10 之間的寡糖[42]，獲得了完整的產物譜。然而，在質譜分析中，LPMOs 反應產物中氧化寡糖和寡糖的質量差為m/z16，與鈉和鉀加合物的質量差一致，而鈉和鉀加合物在大多數實驗條件下存在，從而在質譜分析中會產生m/z值重疊，而MALDI-TOF MS 的分辨率可達40000，可以區分具有重疊m/z值的化合物[50]。因此，MALDI-TOF MS 常作為一種定性評估LPMOs 氧化產物的分析方法[10,21,38,42-45,50]，目前已成功分析了具有幾丁質活性[10,52-53]、半纖維素活性[25,54]和淀粉活性[26]的LPMOs。此外，MALDI-TOF 還可以間接評估LPMOs 的底物特異性。Jensen 等[37]在探究底物特異性時將具有幾丁質活性的ScLPMO10C 突變為具有纖維素活性的LPMOs，借助UHPLC 和MALDI-TOF MS 測定了可溶性殼寡糖的含量，以表征ScLPMO10C 突變前后的氧化活性。

1.5 RP-UHPLC-MS方法

RP-UHPLC 分析LPMOs 氧化產物的應用較少。Frommhagen 等[41]利用還原性的標記物2-氨基苯甲酰胺（2-AB）與C4 氧化寡糖標記，結合RP-UHPLC 成功分離了C4 寡糖。然而，寡糖的還原端與熒光團-胺復合物反應過程中形成的中間體不穩定，因此Frommhagen 等[41]在不添加強還原劑的情況下，采用非緩沖洗脫液成功鑒定了寡糖和C4 氧化寡糖。該方法補充了C4 氧化產物的分析方法，相對于PGC 方法，其優點是改進了對纖維寡糖和C4 氧化寡糖的分析和鑒定[3]，并因使用了非緩沖洗脫液，對質譜靈敏度的影響較小。

在色譜-質譜聯用法中，HPAEC-PAD 是LPMOs 活性檢測方法中靈敏度最高的方法，可以分析聚合度較高的氧化產物，但不能與質譜法直接兼容。與HPAEC-PAD 相比，HILIC 和PGC-LC 可與質譜法直接兼容從而實現高靈敏度分析。可以利用HPAEC-PAD 結合ESI-MS 分析C1 氧化產物[10,29]以及PGC 和CAD分離解析C4 氧化產物[40]，兩者結合可以獲得纖維素產物譜信息。幾丁質氧化產物常以HILIC 結合MALDI-TOF MS 進行分析，從而表征LPMOs 活性[42]。在新酶挖掘及酶學特性的研究中，色譜-質譜聯用法仍是可靠的分析方法。

2 基于比色法的LPMOs活性的快速測定

色譜-質譜聯用法雖具有高靈敏度的特點，但其儀器設備昂貴，使用范圍受限。因此，開發快速、簡便的LPMOs 活性檢測方法引起了更多的關注。隨著LPMOs 研究的不斷深入，建立靈敏、快速的酶活檢測方法在LPMOs 的工程化改造過程中具有重要意義。因此，基于LPMOs 催化反應特性的比色法得到了快速發展，傳統的二硝基水楊酸法、高靈敏度的比色法如鎳/鄰苯二酚紫分析法、D-葡萄糖酸/D-葡萄糖酸-δ-內酯分析法以及基于H2O2產量的比色法等，被用于快速穩定地檢測LPMOs 活性。本節以氧化產物的類型為主線，結合方法應用和LPMOs 活性檢測的時間先后順序，分別基于生成的還原糖產物、C1 氧化產物以及H2O2等對基于比色法的LPMOs 活性檢測方法進行闡述。

2.1 二硝基水楊酸法

二硝基水楊酸法（3,5-Dinitrosalicylic acid，DNS）最初用于測定還原糖，通過還原糖與二硝基水楊酸在堿性條件下發生氧化還原反應，并在540 nm 處測定反應產物的吸光度確定還原糖的含量[55]。該方法早期用于LPMOs 的活性測定，通過比較單一水解酶活性和經LPMOs 協同作用的酶活性的差值判定LPMOs 活性。Kim 等[56]結合高效液相色譜法和DNS 法測定了葡萄糖和纖維二糖的含量，從而表征了CgAA9 和纖維素酶的協同作用。該方法操作簡單，但表征LPMOs 活性的靈敏度較低。Deshavath 等[55]發現在呋喃糖存在的條件下，測得的還原糖含量遠高于實際值，并且未檢測到非還原性寡糖。因此，該方法適用于探究LPMOs 的協同作用，而局限于混合產物中單糖的定量分析。

2.2 鎳/鄰苯二酚紫分析法

Wang 等[57]基于丙烯酸定量檢測法開發了鎳/鄰苯二酚紫分析法用于LPMOs 活性檢測。該方法結合C1 氧化產物醛糖酸呈負電荷的特點，并基于鄰苯二酚紫（Pyrocatechol violet，PV）與金屬陽離子如Cu2+和Ni2+等螯合形成金屬離子-PV 復合物在特定波長下有特征吸收，通過測定Ni2+-PV 在650 nm 處的吸光值，達到快速測定LPMOs 活性的目的。該方法還可根據離子吸附/解吸附原理，收集產物與Ni2+共孵育并加入PV，測定上清液中游離的Ni2+含量，從而計算多糖表面產生羧酸根的量。Ni 等[58]應用Ni2+-PV 法檢測PcLPMO9D 酶活性時發現高濃度的LPMOs 對纖維素酶有影響。然而，該方法也存在局限性，在檢測羧酸根含量時，Ni2+-羧酸不遵循1∶2 的比例結合[57]，從而不能精準定量檢測醛糖酸。因此，該方法適用于不同家族中LPMOs 活性的比較，以及LPMO 底物特異性的研究。

2.3 D-葡萄糖酸/D-葡萄糖酸-δ-內酯分析法

鑒于LPMOs 催化反應底物形式的單一性，Keller 等[59]開發了一種快速測定微晶纖維素和預處理麥秸中葡萄糖酸的方法。利用糖苷水解酶處理TtLPMO9E 酶解產物，通過D-葡萄糖酸/D-葡萄糖酸-δ-內酯分析試劑盒（D-Gluconic acid/D-Glucono-δ-lactone assay）測定反應產物葡萄糖酸。利用葡萄糖酸激酶、NADP 和6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶催化將葡萄糖酸轉化為核酮糖-5-磷酸和NADPH，通過測定NADPH 在340 nm 處的吸光值測定LPMOs 活性。該方法測定葡萄糖酸的LOD 值可低至0.27 mg/L，與HPAEC-PAD相比，其靈敏度可以實現對LPMOs 反應產物的定量分析[3,59]。然而，該方法在更改條件時需進行校準，以排除潛在的干擾。

2.4 基于H2O2的量間接檢測LPMOs活性

上述檢測方法均需借助氧化產物對LPMOs 活性進行定量分析，而根據LPMOs 的催化機理[2]，還可通過H2O2的量表征其活性。LPMOs 活性中心的Cu（Ⅱ）被還原成Cu（Ⅰ），與O2結合形成活化的銅-氧復合物，使底物被氧化，進而使糖苷鍵斷裂[10,60]，產生氧化產物和水（圖3-b）。研究表明，H2O2也作為LPMOs 的動力學相關共底物[61]，即Cu（Ⅰ）從底物中獲取氫原子并使之羥基化[61-62]，進而實現糖苷鍵斷裂（圖3-c）。圖3 中b 和c 兩種催化反應途徑是以多糖為底物，其產生的氧化產物通過上述方法可以進行檢測[10,61]；圖3 中的途徑a 是在沒有多糖底物的條件下，Cu（Ⅰ）與O2反應產生H2O2[2]。目前，通過測定H2O2的量表征LPMOs 活性的方法有傳統的Amplex red 過氧化物酶偶聯分析法、靈敏的2,6-二甲基苯酚比色法和準確度較高的還原酚酞分析法。

圖3 LPMOs 的催化機理：（a） 沒有底物的催化反應[2]; （b） O2 為共底物[10]; （c） H2O2 為共底物[61]Fig.3 Catalytic mechanism of LPMOs:(a)No substrate [2]; (b)O2 as co-substrate[10]; (c)H2O2 as co-substrate[61]

2.4.1 Amplex red過氧化物酶偶聯分析法

Amplex red 過氧化物酶偶聯分析法是經典的測定過氧化物及H2O2的分析方法，在過氧化物酶（HRP）催化下，H2O2與Amplex red 按1∶1 的比例生成紅色高熒光的試鹵靈（Resorufin）（圖4）[63]。通過分光光度法（ε571=58000 L/（mol·cm）或熒光法（λEx/Em=569/585 nm）測定其熒光強度[63]，間接測定LPMOs 活性。該方法操作快速，已被廣泛用于LPMOs 活性評估和高通量篩選[64]。Mutahir 等[42]利用該方法通過檢測H2O2的產率表征了LPMOs 活性。Limsakul 等[28]通過Amplex?Red 過氧化氫/過氧化物酶檢測試劑盒測定了LPMOs 活性，H2O2的濃度在0.1～2 μmol/L 范圍內與熒光信號響應呈線性關系，并且當LPMOs濃度為5 μmol/L 時，曲線擬合較好（R2=0.99）[63]。然而，該方法只能精準測定濃度在20～574 mg/L 范圍內的LPMOs[65]，并且其檢測環境需要避免金屬離子的干擾，如游離Cu2+的存在可能導致假陽性結果[54]。

圖4 Amplex red 過氧化物酶偶聯法的原理[63]Fig.4 Principle of Amplex red peroxidase-coupled assay[63]

2.4.2 2,6-二甲基苯酚比色法

Breslmayer 等[65,66]開發了2,6-二甲基苯酚（2,6-Dimethoxyphenol，2,6-DMP）比色法，并用于快速評估LPMOs 活性。LPMOs 將兩分子的2,6-DMP 氧化為兩分子的2,6-DMP 自由基，因自由基不穩定而自發聚合成氫化木酚酮（Hydrocoerulignone），最后經LPMOs 氧化形成顯色產物木質素（Coerulignone），根據木質素在469 nm 處的特征吸收峰表征LPMOs 活性（圖5）[65]。該方法快速、簡便，已被用于裂解纖維素和幾丁質的LPMOs 活性測定，以及LPMOs 表達和純化過程中結合常數或熱穩定性的測定[34,67-69]。2,6-DMP比色法定量LPMOs 的濃度可達0.5～50 mg/L[65]，與Amplex red 過氧化物酶偶聯分析法相比，其靈敏度更高。然而，在酸性緩沖液中，該方法的靈敏度受限。因此，Breslmayr 等[66]在此基礎上進行了改進，以氫化木酚酮為底物測定LPMOs 活性。改進后的方法適用于pH 4～8 的緩沖液環境，并且可以進行準確測定。

圖5 2,6-二甲氧基苯酚（2,6-DMP）比色法的原理[65]Fig.5 Principle of 2,6-dimethoxyphenol (2,6-DMP) assay[65]

2.4.3 還原酚酞分析法

Brander 等[70]基于Kastle-Meyer 實驗原理開發了還原酚酞分析法，并用于LPMOs 活性的快速檢測。以H2O2為共底物，通過LPMOs 氧化將無色的還原酚酞（Reduced phenolphthalein，rPHP）氧化成生酚酞（PHP）（圖6），通過測定PHP 在552 nm 處的吸光值間接測定LPMOs 的活性，以TaAA9A 為例，其活性檢測的LOD 低至15 nmol/L[70]。Brander 等[70]還發現，以脫氫抗壞血酸（DHA）為還原劑時，PHP 更容易定量。然而，抗壞血酸作為還原劑時不能促進rPHP 氧化，反而會引起反應中酶的降解。因此，該分析方法僅限于DHA 的反應中LPMOs 活性評估[70]。與上述兩種比色法相比，該方法因rPHP 的高穩定性和耐受性使得LPMOs 活性測定更準確。

圖6 還原酚酞分析法的原理[70]Fig.6 Principle of reduced phenolphtalein assay[70]

2.5 偶氮木葡聚糖分析

偶氮木葡聚糖分析法（Azo-Xyloglucan Assay）最初應用于纖維素酶中內切葡聚糖酶[71]的活性檢測及木聚糖特異性評估[72]。將可溶性顯色底物偶氮木聚糖與染料雷馬氏亮藍（Remazol brilliant blue R，RBBR）混合，利用纖維素酶水解產生染色寡糖，測定染色寡糖在590 nm 處的吸光值表征內切葡聚糖酶的酶活性[72]。基于此，Calderaro 等[3]利用LPMOs 反應中還原劑的作用，通過測定還原劑添加前后上清液顏色變化定量分析LPMOs 的活性。該方法由于缺乏相應的實驗數據，尚無法評估其優缺點，因此還未得到廣泛應用。

上述比色法均可表征LPMOs 活性，各種比色法靈敏度雖有差異，但在相應的應用范圍中能夠實現精準測定。如DNS 法的靈敏度雖低但可粗略計算酶活性，廣泛用于LPMOs 與水解酶協同作用的活性檢測，鎳/鄰苯二酚紫分析法及D-葡萄糖酸/D-葡萄糖酸-δ-內酯分析法與之相比靈敏度有所提升。在H2O2分析方法中，以Amplex red 過氧化物酶偶聯分析法應用范圍最廣，而2,6-DMP 比色法靈敏度較高。在酶工程改造研究中，比色法可為突變體快速且穩定的篩選提供技術支撐。

3 基于熒光探針標記的LPMOs活性檢測

除上述色譜-質譜聯用法和比色法之外，還有特異性強的熒光探針標記法，通過測定熒光值表征LPMOs 活性，目前用于LPMOs 活性測定的探針標記主要有以下3 種。

3.1 SYTO-62探針標記

SYTO-62 探針標記法最初是測定聚合物表面的羧基， 經Eibinger 等[12]調整改造后， 用熒光探針SYTO-62 標記纖維素后與LPMOs 共孵育，借助激光共聚焦顯微鏡連續監測纖維素結晶區域表面的氧化位點， 確定反應產生羧基的量表征LPMOs 活性， 最后證明源于粗糙脈孢菌Neurospora crassa的NcLPMO9F 在催化纖維素裂解時產生了多個氧化位點。

3.2 EDAC熒光標記

EDAC 熒光標記是基于1-乙基-3-[3-（二甲氨基）丙基]碳二亞胺（EDAC）將醛酸活化，再由胺基熒光團7-氨基-1,3-萘二磺酸（ANDA）胺化，形成的共軛產物在450 nm 處具有熒光吸收[73]。Vuong 等[32]通過將水溶性熒光團共價連接到纖維素氧化部位，再與LPMOs 共孵育，測定熒光吸收值反映PcLPMO9D 活性。該方法常用于評估C1 位氧化LPMOs 活性，并與HPAEC 色譜法結合可以獲得有關LPMOs 氧化產物的更詳細信息。

3.3 ANTS熒光標記

ANTS 熒光標記法是一種基于熒光團8-氨基萘-1,3,6-三磺酸（ANTS）將反應產物胺化而產生還原端，再經聚丙烯酰胺凝膠電泳獲得多糖結構的分析方法，即碳水化合物凝膠電泳（PACE）分析法。該方法通過測定探針標記氧化產物的熒光值表征LPMOs 活性，如Quinlan 等[21]利用ANTS 熒光標記并結合MALDI-TOF-MS 分析了源于Thermoascus aurantiacus的TaGH61A 降解纖維素產物，并比較Cu2+對TaGH61A 催化活性的影響。Frandsen 等[74]應用該方法測定了源于Lentinus similis的氧化產物纖維二糖和纖維三糖，表征了LsLPMO9 活性，并測定了酶催化反應的動力學參數。

4 其它方法

除此之外，結合LPMOs 催化反應中電子受體如氧氣的消耗量、電子供體如抗壞血酸的消耗量均可以間接測定LPMOs 的催化活性。Gusakov 等[75]基于耗氧率測量的方法，使用帶有高靈敏度熒光傳感器的Seahorse XFp 分析儀，監測了3 種真菌LPMOs 對無定形區域纖維素的氧化活性。Yu 等[76]利用LPMOs外部電子供體的抗壞血酸的消耗量表征源于Bacillus atrophaeus的BatLPMO10 的活性。此外，根據磷酸溶脹纖維素（PASC）不透明的特征，LPMOs 裂解氧化PASC 使之溶解，通過檢測其光密度變化表征LPMOs 活性，Hansson 等[77]利用該特性測定HjLPMO9A 與之突變體氧化裂解纖維素活性，得出HjLPMO9A 突變體對纖維素裂解活性下降50%。

5 結論與展望

LPMOs 氧化裂解產物的組成各異，針對可溶性產物，色譜-質譜法及比色法均可實現精準測定，但在分析不溶性產物時存在局限性。熒光標記法更適于不溶性產物的分析，從而可以實現LPMO 整體活性的檢測。隨著LPMOs 研究的不斷深入，自然界中越來越多的LPMOs 被發現，因此需要發展精確且快速的酶活性測定方法，為其酶學特性的研究提供關鍵支持。隨著計算機輔助設計技術的高速發展，蛋白質工程對LPMOs 的改造將成為研究熱點，高通量的LPMOs 活性篩選方法不但可以加速突變體篩選效率，也為LPMOs 的產業化進程奠定了堅實的基礎。因此，LPMOs 酶活性的測定方法需要不斷地開發和創新，以期研發適用性更廣、操作更快速、精度更高的檢測方法，為解決當前方法的局限性提供新思路和新途徑。