缺氧環境下HIF-1調控PAD4介導的H3cit促進子宮內膜腺上皮細胞凋亡

黃 勇, 羅 書, 廖 源, 王開舉

(海南醫學院第二附屬醫院, 海南 海口 570311)

子宮內膜是女性生殖系統中至關重要的組織,其周期性重塑和變化對于妊娠的建立至關重要。這一過程涉及多種激素和轉錄因子的調控,其中子宮內膜腺上皮細胞凋亡在調節子宮內膜結構和功能中起著重要作用[1,2]。但其凋亡的具體形成機制還有待研究。缺氧是許多生理和疾病狀態的共同特征,特別是在妊娠障礙疾病中,缺氧信號發揮關鍵作用[3,4]。在缺氧條件下,缺氧誘導因子1(HIF-1)被激活,從而調控多種基因表達發揮生理性,包括肽基精氨酸脫亞胺酶4(PAD4)[5]。PAD4可以介導蛋白質的精氨酸殘基轉化為瓜氨酸殘基,其產物瓜氨酸化組蛋白H3(H3cit)在凋亡和炎癥反應中發揮重要作用[6]。研究表明,女性PAD4和H3cit的水平增加會引起子宮的損傷和衰竭[7]。然而在子宮內膜腺上皮細胞中,缺氧條件是否可以通過HIF-1調控PAD4基因進而引發凋亡仍不清楚,其相關的機制仍有待進一步研究。在本實驗中,通過構建過表達HIF-1以及沉默PAD4的細胞系,檢測其對子宮內膜腺上皮細胞凋亡的影響,并探討相關機制,為子宮內膜類疾病的發生及治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1實驗材料:宮內膜腺上皮細胞CM-H058(貨號:CM-H058)購自武漢普諾賽生命科技有限公司;胎牛血清(貨號:CMS101.03)購自賽澳美細胞技術(北京)有限公司;qPCR SYBR Green Master Mix(貨號:Q111-02)購自南京諾唯贊醫療科技有限公司;HIF-1、PAD4、Caspase3、Caspase7基因引物由上海生工生物工程公司合成;HIF-1(貨號:ab1)、H3cit(貨號:ab5103)、Caspase3(貨號:ab32351)、Caspase7(貨號:ab255818)抗體購自abcam公司;PAD4(貨號:17373-1-AP)抗體購自武漢三鷹公司;細胞凋亡檢測試劑盒(貨號:E-CK-A211)購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司;MinElute PCR純化試劑盒(貨號:57704)購自德國Qiagen;oe-PAD4、oe-NC以及sh-NC、sh-HIF-1慢病毒質粒湖南豐暉生物科技有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養:宮內膜腺上皮細胞CM-H058培養于RIPM 1640培養基中,培養基中添加10%胎牛血清、青霉素(100U/mL)和鏈霉素(100μg/mL)。當細胞密度生長至80%時進行細胞傳代,并適時更換新鮮培養基以供細胞生長需要,將細胞培養在37℃,含5%CO2的濕化培養箱中。

1.2.2慢病毒轉染法構建過表達HIF-1/沉默PAD4的細胞系:將細胞以2×105的密度接種在六孔培養皿中,等待細胞生長密度到達70%時轉染病毒。分別設置oe-NC組(轉染oe-NC)、oe-PAD4組(轉染oe-PAD4)、oe-PAD4+sh-NC組(轉染oe-PAD4與sh-NC)、oe-PAD4+sh-HIF-1組(轉染oe-PAD4與sh-HIF-1)。每孔所需病毒量[病毒體積=(MOI×細胞數量)/病毒滴度,病毒滴度=2×108TU/mL],病毒感染約72h后,將培養基更換為含有4μg/mL嘌呤霉素的選擇培養基。分離嘌呤霉素抗性細胞克隆,在含有2μg/mL嘌呤霉素的培養基中擴增7d,然后轉移到不含嘌呤霉素的培養基中。

1.2.3qRT-PCR檢測HIF-1、PAD4、Caspase3、Caspase7基因表達水平:TRizol試劑提取細胞中的總RNA,使用酶標儀檢測RNA純度和濃度。依據strand cDNA Synthesis試劑盒操作說明進行逆轉錄實驗。按照qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒指示配制qRT-PCR反應體系。以GAPDH為引物,按照2-ΔΔCt公式計算基因相對表達量。引物序列如下:HIF-1,正向:CCCCGAGTTGCAGTATCAAAT,反向:AACGGACAAACGGACACACA;PAD4,正向:AAACGCGTGATGGGCTTCC,反向:AAGAAAGCAAGCCACTGCTG;Caspase3,正向:GAGCTTGGAACGGTACGCTA,反向:CCGTACCAGAGCGAGATGAC;Caspase7,正向:CCGTGGGAACGATGACCG,反向:GATTCATCAACGAACGGCGG;GAPDH,正向:AATGGGCAGCCGTTAGGAAA;反向:GCGCCCAATACGACCAAATC。

1.2.4Western blot HIF-1、PAD4、H3cit、Caspase3、Caspase7的蛋白表達水平:用RIPA裂解緩沖液提取細胞中的總蛋白,并使用BCA測定蛋白濃度。通過12% SDS-PAGE電泳分離蛋白質(120V,90min)并轉移至PVDF膜(300mA,60min)。隨后,將PVDF膜用5%脫脂牛奶室溫封閉60min,并與一抗(均按1∶1,000稀釋)在4℃下孵育過夜。然后將膜與抗兔二抗(1∶5000稀釋)在室溫下孵育2h。使用ECL試劑盒檢測蛋白質條帶,并使用生物放射成像系統量化每種蛋白質的相對表達。

1.2.5流式細胞術檢測細胞凋亡水平:用預冷的磷酸鹽緩沖鹽水PBS洗滌細胞兩次,并根據制造商的說明進行細胞凋亡測定。簡而言之,每管加入100μL 1×結合緩沖液,充分懸浮細胞。加入染料并將細胞在室溫下避光孵育15min,然后加入300μL 1×結合緩沖液懸浮細胞。然后將細胞懸液轉移至避光的5mL流式細胞儀管中,并在1h內進行流式細胞術。

1.2.6ChIP-qPCR檢測PAD4和H3cit在Caspase3、Caspase7轉錄起始位點(TSS)富集水平:CM-H058細胞在15cm平板中生長至85%匯合度。細胞在1%甲醛中固定8min。通過超聲處理對染色質進行剪切,4℃12000r/min離心10min。每個ChIP10μg HIF-1抗體,孵育過夜,離心后去上清,加入洗脫緩沖液,室溫孵育10min,離心后收集上清,65℃ 6h。通過MinElute PCR純化試劑盒純化DNA。參考1.2.3進行qRT-PCR檢測。TSS引物序列:Caspase3,正向:GTCATCTCGCTCTGGTACGG,反向:CACACACACAAAGCTGCTCC、Caspase7,正向:ACTTCGACAAAGCGACAGGT,反向:GTCACGCCATCTTTCCCGTA。

2 結 果

2.1缺氧環境下HIF-1、PAD4、H3cit以及細胞凋亡水平升高:qRT-PCR結果顯示,與常氧組比較,缺氧組HIF-1、PAD4、Caspase3、Caspase7基因表達升高(P<0.05),見表1。Western blot結果顯示,與常氧組比較,缺氧組HIF-1、PAD4、H3cit、Caspase3、Caspase7蛋白表達升高(P<0.05),見圖1和表2。流式細胞術結果顯示,與常氧組比較,缺氧組細胞凋亡水平升高(P<0.05),見表3。

表1 兩組細胞中HIF-1 PAD4 Caspase3 Caspase7基因表達比較

表2 兩組細胞中HIF-1 PAD4 H3cit Caspase3 Caspase7蛋白表達比較

表3 常氧組和缺氧組細胞凋亡率比較

圖1 兩組細胞HIF-1、PAD4、H3cit、Caspase3、Caspase7蛋白表達曝光圖

2.2敲低HIF-1抑制PAD4、H3cit以及細胞凋亡水平:qRT-PCR結果顯示,與sh-NC組比較,sh-HIF-1組HIF-1、PAD4、Caspase3、Caspase7基因表達降低(P<0.05),見表4。Western blot結果顯示,與sh-NC組比較,sh-HIF-1組HIF-1、PAD4、H3cit、Caspase3、Caspase7蛋白表達降低(P<0.05),見圖2和表5。流式細胞術結果顯示,與sh-NC組比較,sh-HIF-1組細胞凋亡水平降低(P<0.05),見表6。

表4 敲低HIF-1對PAD4 Caspase3 Caspase7基因表達的影響

表5 敲低HIF-1對PAD4 H3cit Caspase3 Caspase7蛋白表達的影響

表6 敲低HIF-1對細胞凋亡的影響

圖2 敲低HIF-1后細胞HIF-1、PAD4、H3cit、Caspase3、Caspase7蛋白表達曝光圖

2.3過表達PAD4拮抗HIF-1對細胞凋亡的影響:qRT-PCR結果顯示,與sh-HIF-1+oe-NC組比較,sh-HIF-1+oe-PAD4組PAD4、Caspase3、Caspase7基因表達升高(P<0.05),見表7。Western blot結果顯示,與sh-HIF-1+oe-NC組比較,sh-HIF-1+oe-PAD4組PAD4、H3cit、Caspase3、Caspase7蛋白表達升高(P<0.05),見圖3和表8。流式細胞術結果顯示,與sh-HIF-1+oe-NC組比較,sh-HIF-1+oe-PAD4組細胞凋亡水平升高(P<0.05),見表9。

表7 過表達PAD4對Caspase3 Caspase7基因表達的影響

表8 過表達PAD4對H3cit Caspase3 Caspase7蛋白表達的影響

表9 過表達PAD4對細胞凋亡的影響

圖3 過表達PAD4后細胞H3cit、Caspase3、Caspase7蛋白表達曝光圖

2.4過表達PAD4促進Caspase3、Caspase7基因轉錄:ChIP-qPCR結果,與sh-HIF-1+oe-NC組比較,sh-HIF-1+oe-PAD4組PAD4、H3cit和H3K27ac在Caspase3、Caspase7 TSS富集水平增加(P<0.05),見表10。

表10 兩組細胞PAD4和H3cit在Caspase3 Caspase7 TSS富集比較(/input %)

3 討 論

恒定的氧氣供應對于正常的組織功能、發育和體內平衡至關重要,在缺氧微環境下,細胞的代謝將會重編程,激活不同的分子信號通路以適應缺氧環境,包括血管生成、葡萄糖代謝和細胞增殖等生理過程。當氧水平下降時,細胞會通過一系列基因和蛋白表達的調控從而引發細胞凋亡[8]。細胞凋亡可以清除功能失調的細胞,在維持正常組織的生理功能中起著至關重要的作用,但是異常或過度的細胞凋亡將會導致組織損傷[9]。子宮內膜腺上皮細胞的過度凋亡將導致子宮內膜損傷,炎癥細胞以及炎性因子浸潤,進而進一步破壞子宮內膜屏障功能[10]。因此探究缺氧條件下子宮內膜腺上皮細胞的凋亡分子機制對緩解子宮內膜損傷有治療意義。

HIF-1是一種異二聚體轉錄因子,它可以協調機體的適應性反應,以維持氧穩態和適應低氧水平[11]。HIF-1參與胚胎發育、腫瘤生長、轉移和缺氧誘導的細胞凋亡等過程[12]。既往研究表明,缺氧條件下,HIF-1表達上調,可通過兩種機制誘導細胞凋亡[13]。在本實驗中,在缺氧環境下,HIF-1表達水平以及細胞凋亡相關蛋白(Caspase3、Caspase7)表達水平均顯著增加,而敲低HIF-1可以降低細胞的凋亡水平,說明缺氧可以誘導子宮內膜腺上皮細胞凋亡,并與HIF-1的表達上調有關。近期研究表明,H3cit表現出高細胞毒性,可能引起組織損傷,導致多器官衰竭[14]。在本實驗中,在缺氧環境下,PAD4、H3cit的表達均上調,同時過表達PAD4可逆轉敲低HIF-1對細胞凋亡的促進作用,說明PAD4及其介導的H3cit可能位于HIF-1的下游,并參與了缺氧誘導的細胞凋亡。H3cit形成后,組蛋白與DNA的靜電結合能力減弱,促進RNA聚合酶Ⅱ能夠進入DNA并將其轉錄成mRNA[3]。為進一步探索PAD4介導H3cit如何誘導細胞凋亡。本實驗通過ChIP-qPCR實驗檢測了PAD4和H3cit在Caspase3、Caspase7 TSS富集水平,發現過表達PAD4促進PAD4和H3cit在Caspase3、Caspase7 TSS富集水平。提示PAD4介導的H3cit可以促進Caspase3、Caspase7基因轉錄,最終誘導子宮內膜腺上皮細胞凋亡。

綜上所述,本研究發現缺氧環境下HIF-1與PAD4表達水平增加,HIF-1可以促進PAD4表達。PAD4的表達上調后介導H3cit,進一步誘導凋亡相關蛋白Caspase3、Caspase7的基因轉錄,導致宮內膜腺上皮細胞凋亡。以上結果初步明確了缺氧環境下HIF-1與PAD4介導H3cit形成在子宮內膜腺上皮細胞凋亡中的作用,可為進一步探索子宮內膜相關疾病的治療提供思路。