阿替普酶聯合紅花提取物調節TLR4-NLRP3信號通路對大鼠急性腦梗塞的影響

劉明亮, 楊森林, 馬 超

(河北省滄州中西醫結合醫院急診科, 河北 滄州 061001)

急性腦梗塞(Acute cerebral infarction,ACI)是腦部因血液供應不足導致局部缺血缺氧引起腦組織出現壞死和軟化的癥狀,多發病于老年人,數據顯示,ACI患者年齡有年輕化趨勢,嚴重威脅人們的身體健康[1]。阿替普酶是一種血栓溶解藥物,能夠直接激活纖維酶原轉化為纖溶酶來降解纖維蛋白,在治療心肌梗死上具有顯著效果[2]。于海燕等[3]發現阿替普酶可促進腦梗死大鼠神經功能恢復。然而,溶栓治療的時間窗口很窄,并與腦出血等致命性并發癥有關[4]。紅花提取物來自菊科植物紅花(Carthamus tinctorius L.),現代藥理實驗表明紅花提取物可影響血小板的聚集,能夠延長凝血時間,抑制血栓形成,對于大鼠急性心肌缺血有很好的保護作用[5]。但關于紅花提取物聯合阿替普酶是否能夠起到聯合療效,并獲得更有益作用的研究尚未見報道。TLR4-NLRP3通路被認為參與調節炎癥反應、細胞凋亡等的重要信號通路[6]。楊波等[6]發現原花青素可通過抑制TLR4-NLRP3通路對腦缺血再灌注損傷起保護作用。本研究對阿替普酶聯合紅花提取物可通過調節TLR4-NLRP3通路改善ACI損傷進行了探索,以期為ACI的治療提供數據參考。

1 材料與方法

1.1實驗動物:SPF級SD大鼠30只(雌雄各半),體質量220～250g,由河北醫科大學(實驗動物公共服務平臺)提供,使用許可證號:SYXK(冀)2020-002,生產許可證號:SCXK(冀)2020-001,大鼠飼養于恒溫(22～25)℃、恒濕的SPF層流罩中。

1.2藥物與試劑:阿替普酶(CAS:105857-23-6,純度≥98%)購自LGM Pharma(北京);紅花提取物(批號:20130326)購自遠方藥業有限公司;2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC,批號:C428BA0042)購自上海生物工程股份有限公司;EB染料(批號:71016588)購自上海國藥化學試劑有限公司;Trizol試劑(批號:15596018)購自美國Invitgen;PrimeScriptTM RT試劑盒(批號:RR047A)購自日本Takara;相關一抗MMP-2(貨號:ab92536)、MMP-9(貨號:ab283575)、Bax(貨號:ab32503)、Bcl-2(貨號:ab182858)、TLR4(貨號:ab13556)、NF-κB p65(貨號:ab288751)、p-NF-κB p65(貨號:ab239882)、NLRP3(貨號:ab263899)、caspase1(貨號:ab207802)、pro-IL-1β(貨號:ab216995)及二抗(貨號:ab6721)購自英國Abcam;BCA蛋白濃度測定試劑盒(貨號:P0009)購自Beyotime;ECL發光試劑盒(貨號:KF001)購自Affinity。

1.3主要儀器:SpectraMAX Plus384酶標儀購自美谷分子儀器有限公司生產;BA210Digital數碼三目攝像顯微鏡購自麥克奧迪實業集團有限公司;JY200C電泳儀購自北京君意東方電泳設備有限公司。

1.4急性腦梗塞大鼠模型制備:大鼠適應性飼養1周后,進行ACI模型建立[7]:首先用1.5%戊巴比妥鈉(30mg/kg)麻醉大鼠,仰臥固定于實驗臺,充分暴露其頸部皮膚,75%酒精消毒,通過頸正中切口分離大鼠左側頸總動脈(CCA)、頸內動脈(ICA)和頸外動脈(ECA)。將直徑0.26mm的圓形尖端單絲尼龍縫線引入ECA管腔,然后輕輕推進到ICA,以阻斷大腦中動脈(MCA)的起始點。假手術組大鼠將尼龍線插入ECA管腔,但不向頸內動脈推進。阻斷2h后,拔除尼龍線,縫合傷口,75%乙醇消毒。模型制備完成以后,給予大鼠抗感染護理,大鼠蘇醒后,進行神經功能評定,得分大于3,則視為ACI造模成功。

1.5分組及給藥方法:將建模成功的大鼠隨機分模型組、阿替普酶組(尾靜脈注射阿替普酶5mg/kg)、紅花提取物組(尾靜脈注射4g/kg)、阿替普酶聯合紅花提取物組,每組6只,假手術組6只。阿替普酶組大鼠按5mg/kg劑量尾靜脈注射阿替普酶;紅花提取物組大鼠尾靜脈注射紅花提取物4g/kg;阿替普酶聯合紅花提取物組尾靜脈注射阿替普酶(5mg/kg)+紅花提取物(4g/kg);假手術組和模型組大鼠注射等體積的無菌0.9%氯化鈉溶液,連續治療7d。

1.6觀察指標

1.6.1神經功能缺損評分:根據Zea Longa等的五級分級系統評價神經功能:0分為無缺陷;1分為不能伸展對側前爪;2分為縱向旋轉;3分為跌向對側;4分為不能自發行走。

1.6.2TTC染色評價梗死面積:最后一次給藥4h后,處死大鼠,取出腦組織,在-20℃下冷凍15min,切成1mm厚的冠狀切片,用2%的TTC在37℃孵育15min,梗死區組織呈白色,正常組織呈紅色。采用ImageJ軟件測量切片面積。

1.6.3HE染色觀察組織病理變化:取腦組織制作石蠟切片,蘇木精-伊紅(HE)染色,觀察腦組織的病理形態。光鏡下觀察腦組織病理變化。

1.6.4伊文思藍(Evans blue)含量測定:分別取各組2只大鼠,在最后一次給藥后3h經股靜脈注射3%EB染料(20μL/10g體重)。大鼠注射EB后1h,灌流生理鹽水100mL 1h后,取腦組織,兩個大腦半球沿矢狀縫分開,取缺血側大腦半球稱重,在60℃的3mL甲酰胺中孵育24h,3000r/min離心20min,上清液在632nm波長處用測定吸光度。用標準曲線計算腦組織中EB的含量為ng/g。

1.6.5TUNEL法檢測各組細胞凋亡:將腦組織切片切成4～6m厚,腦切片在37℃下與末端脫氧核苷酸轉移酶(TDT)孵育1h,用PBS洗滌3次,然后在室溫下與IgG孵育30min。以0.02% H2O2為酶底物,以四氯化二氨基聯胺(DAB)為顯色劑,顯色。計數來自每個切片的5個不同區域的細胞。

1.6.6qRT-PCR檢測TLR4、NF-κB p65、NLRP3表達:使用Trizol試劑提取腦組織總RNA,然后使用PrimeScriptTM RT試劑盒將RNA反向轉錄為cDNA,作為聚合酶鏈式反應擴增的模板。使用SYBR PreMix Ex TaqTM Ⅱ定量基因表達水平,使用的基因特異性引物如下:TLR4:正向:5'-ATC GGTGGTCAGTGTGCTTGTGGTAG-3',反向:5'-TTCCTGGATGATGTTGGCAGCAATGG-3';NF-κB p65:正向:5'-GCCAGCACCAAGACCGAAGCAATT-3',反向:5'-TACCGCCAGCAGCATCTTCAC ATCTC-3';NLRP3:正向:5'-ACCACCACCTCCAAGACCACCACGG-3',反向:5'-GCCATCAGCAGCCAA GGAGCAGAGA-3';GAPDH:正向:5'-TGAAGAACAGGGAAGCAGCAA-3',反向:5'- ATCCAGTCCATT TTCCACCACA-3'。以GAPDH作為內參。qRT-PCR反應條件:95℃初始變性10min,隨后95℃變性10s,60℃退火10s,72℃延伸10s,45個循環,記錄CT值,采用2-△△CT分析相對表達水平。

1.6.7Western blotting分析腦組織MMP-2、MMP-9、Bax、Bcl-2、TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB p65、NLRP3、caspase1、pro-IL-1β蛋白表達:收集的腦組織在含有蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液中裂解。冰上孵育離心后,收集上清液,用BCA法檢測蛋白質濃度,并通過SDS-PAGE電泳法進行蛋白質分離。然后將蛋白質轉移到PVDF膜上,用5%脫脂牛奶中室溫封閉2h后,以β-actin為內參,分別與MMP-2(1∶500)、MMP-9(1∶500)、Bax(1∶500)、Bcl-2(1∶500)、TLR4(1∶500)、NF-κB p65(1∶500)、p-NF-κB p65(1∶500)、NLRP3(1∶500)、caspase1(1∶500)、pro-IL-1β(1∶500)和β-actin (1∶1000)抗體在4℃孵育過夜。用TBST沖洗膜3次,用與辣根過氧化物酶(HRP)偶聯的二級抗體(1∶500)37℃孵育1h,用ECL試劑顯帶。采用ImageJ軟件計算灰度值。

2 結 果

2.1阿替普酶聯合紅花提取物對急性腦梗大鼠腦組織損傷的影響:與假手術組相比,模型組Zea Longa評分顯著升高,梗死面積顯著增加(P<0.01),腦組織大量錐體細胞壞死。與模型組相比,紅花提取物組、阿替普酶聯合紅花提取物組Zea Longa評分顯著降低,梗死面積顯著減小(P<0.05),腦組織局部區域大量錐體細胞壞死,細胞形態較為清晰,且阿替普酶聯合紅花提取物組改善效果更為明顯。與阿替普酶組相比,阿替普酶聯合紅花提取物組梗死面積顯著下調(P<0.05),腦組織輕微受損。見圖1。

圖1 各組大鼠腦組織損傷比較

2.2阿替普酶聯合紅花提取物對急性腦梗大鼠血腦屏障破壞的影響:與假手術組相比,模型組EB含量及MMP-2、MMP-9蛋白表達顯著上調(P<0.01);與模型組相比,阿替普酶組、紅花提取物組、阿替普酶聯合紅花提取物組EB含量及MMP-2、MMP-9蛋白表達顯著下調(P<0.05);與阿替普酶組相比,阿替普酶聯合紅花提取物組EB含量及MMP-2、MMP-9蛋白表達顯著降低(P<0.05)。見圖2。

圖2 各組大鼠血腦屏障破壞比較

2.3阿替普酶聯合紅花提取物對急性腦梗大鼠組織細胞凋亡的影響:與假手術組相比,模型組細胞凋亡率、Bax蛋白表達顯著增加,Bcl-2蛋白表達顯著降低(P<0.05);與模型組相比,阿替普酶組、紅花提取物組、阿替普酶聯合紅花提取物組細胞凋亡率、Bax蛋白表達顯著降低,Bcl-2蛋白表達顯著升高(P<0.05);與阿替普酶組比較,阿替普酶聯合紅花提取物組Bax蛋白表達顯著降低(P<0.05)。見圖3。

圖3 各組大鼠細胞凋亡比較

2.4阿替普酶聯合紅花提取物對急性腦梗大鼠TLR4/NLRP3通路的影響:與假手術組相比,模型組TLR4、NF-κB p65、NLRP3 mRNA表達及TLR4、NF-κB p65、NLRP3、p-NF-κB p65、caspase1、pro-IL-1β蛋白表達顯著上調(P<0.05);與模型組相比,阿替普酶聯合紅花提取物組TLR4、NF-κB p65、NLRP3 mRNA表達及TLR4、NF-κB p65、NLRP3、p-NF-κB p65、caspase1、pro-IL-1β蛋白表達顯著下調(P<0.05);與阿替普酶組相比,阿替普酶聯合紅花提取物組NF-κB p65、NLRP3、p-NF-κB p65蛋白表達顯著下降(P<0.05)。見圖4。

圖4 各組大鼠TLR4/NLRP3通路因子表達水平比較

3 討 論

近年來,ACI發病率呈上升態勢,2016年我國缺血性腦卒中患病率達到1762.77/10萬,改善ACI損傷已顯得十分重要[1]。本研究探討了阿替普酶聯合紅花提取物對ACI的影響。研究報道,神經功能缺失評分、腦梗塞面積、腦組織病理損傷和腦組織水腫是評價腦損傷的常用指標,大腦中動脈閉塞可導致神經功能障礙[7]。本研究通過線栓法建立大鼠ACI模型后,首先觀察到模型大鼠神經功能缺失評分、腦梗塞面積顯著高于假手術組,且腦組織受損較為明顯。阿替普酶聯合紅花提取物干預可顯著改善神經功能缺失評分,減輕腦梗塞面積,改善腦組織病理損傷。提示阿替普酶聯合紅花提取物對ACI具有神經保護作用。

據報道,Bcl-2家族蛋白可調節線粒體凋亡信號的激活,其機制與調節線粒體外膜通透性有關[8]。Bcl-2具有抗細胞凋亡和延長細胞壽命作用,ACI后Bax的高表達拮抗Bcl-2作用,研究發現通過在腦缺血損傷后的不同時間增加Bax/Bcl-2比率,可使細胞易發生細胞凋亡[9]。本研究結果顯示,ACI大鼠Bcl-2的表達顯著降低,Bax的表達顯著升高,表明ACI誘導細胞凋亡。經阿替普酶聯合紅花提取物治療后,Bcl-2的表達顯著上調,Bax的表達顯著下調,暗示阿替普酶聯合紅花提取物抑制ACI細胞凋亡。此外,TUNEL細胞凋亡結果顯示,ACI細胞凋亡率顯著升高,阿替普酶聯合紅花提取物可顯著降低細胞凋亡率。表明阿替普酶聯合紅花提取物對ACI的保護作用可能與抑制細胞凋亡有關。

TLRs是一種模式識別受體,可與病原體相關分子模式結合,在先天免疫和獲得性免疫中發揮重要作用,TLR4是TLRs家族的成員之一,研究發現TLR4在腦缺血再灌注損傷模型中被顯著激活[10]。此外,炎性小體在不同疾病中發揮關鍵作用,包括缺血性腦損傷、神經退行性疾病和自身免疫性疾病[11]。NLRP3炎癥體是由NLRP3連接到caspase1上形成的大分子復合體,可被ATP、mtDNA、細菌和病毒成分等刺激激活。研究顯示NLRP3炎癥體可以被大腦中動脈阻塞激活,過度激活的NLRP3炎癥體可以將失活的pro-caspase1轉化為活性的caspase1,從而誘導IL-1β和IL-18促炎細胞因子的分泌[12]。TLR4可活化NF-κB,活化的NF-κB從細胞質轉移至細胞核中,從而促進NLRP3的釋放[13]。研究報道金合歡素可通過調節TLR4/NLRP3信號通路,實現對腦缺血再灌注損傷模型大鼠的保護作用[14]。本研究得出類似結果,在本研究中,ACI大鼠中TLR4、NF-κB p65、NLRP3、p-NF-κB p65、caspase1、pro-IL-1β的表達顯著增加,而阿替普酶聯合紅花提取物使TLR4、NF-κB p65、NLRP3、p-NF-κB p65、caspase1、pro-IL-1β的表達顯著降低。提示阿替普酶聯合紅花提取物可能通過抑制TLR4-NLRP3信號通路進而起到對ACI的保護作用。

綜上所述,ACI會誘發大腦中的細胞凋亡,損害神經功能,阿替普酶聯合紅花提取物可通過抑制TLR4-NLRP3信號通路及減少細胞凋亡,從而改善ACI受損的神經功能。揭示了阿替普酶聯合紅花提取物對ACI的神經保護功能的潛在機制,并暗示阿替普酶聯合紅花提取物可能是ACI的一種潛在治療方法。