槲皮素調(diào)控SOCS3/STAT3信號(hào)通路對(duì)甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

韓 克, 董保華, 孟佳佳, 徐娜娜

(1.山東省濟(jì)南市第五人民醫(yī)院普外二科, 山東 濟(jì)南 250000 2.中國(guó)石油大學(xué)醫(yī)院/華東, 山東 青島 266580)

甲狀腺癌較常見(jiàn)的癌癥,而甲狀腺乳頭狀癌(PTC)在其中占據(jù)比例最大,約占所有甲狀腺癌的85%-90%。雖然PTC是一種惡性程度較低、相對(duì)溫和的癌癥,但其發(fā)病率逐年增加[1]。因此研究PTC進(jìn)展的作用機(jī)制及潛在治療藥物對(duì)于改善PTC預(yù)后具有重要意義。槲皮素(Que)是一種多酚類黃酮,可從植物性食物和多種中藥中獲得。值得關(guān)注的是,Que可抑制甲狀腺癌細(xì)胞生長(zhǎng),并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,是一種有前途治療甲狀腺癌的候選藥物,但其機(jī)制尚不明確。細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制分子3(SOCS3)是SOCS家族最活躍的成員之一。SOCS3作為JAK2/STAT3信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控因子,在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用[2]。有研究顯示,Que可通過(guò)調(diào)節(jié)SOCS3/STAT3信號(hào)通路發(fā)揮抗關(guān)節(jié)炎作用[3]。但Que能否通過(guò)SOCS3/STAT3信號(hào)通路發(fā)揮抗腫瘤的作用尚未報(bào)道,本研究旨在探討Que調(diào)控SOCS3/STAT3信號(hào)通路對(duì)PTC細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞來(lái)源:人乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞TPC-1購(gòu)自國(guó)家鑒定細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(中國(guó)上海),細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清和1%青霉素和鏈霉素的新鮮RPMI 1640培養(yǎng)基中。

1.2主要材料、儀器:上海莼試生物技術(shù)有限公司提供Que;廣州銳博生物技術(shù)有限公司提供SOCS5干擾RNA(SOCS3 shRNA)及陰性對(duì)照(shRNA NC);上海生工生物有限公司提供qRT-PCR所用引物;AccuRef Scientific公司提供CCK-8;Invitrogen公司提供TRIzol試劑、RIPA緩沖液;TaKaRa公司提供prime script RT試劑盒;Abcam公司提供SOCS3、p-STAT3、STAT3、磷酸化非受體酪氨酸激酶Janus激酶2(p-JAK2)、JAK2一抗、細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒;Millipore提供PVDF膜。Thermo Fisher Scientific提供ABI7300系統(tǒng);美谷分子儀器有限公司提供SpectraMAX Plus384酶標(biāo)儀。

1.3細(xì)胞分組及處理:取融合度達(dá)到80%的TPC-1細(xì)胞進(jìn)行設(shè)置分組:對(duì)照組、Que低(Que-L)、中(Que-M)、高濃度(Que-H)組、Que-H+shRNA NC組、Que-H+SOCS3 shRNA組。其中Que-L、Que-M、Que-H組經(jīng)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)及文獻(xiàn)參考[4]分別以25μmoL/L Que、50μmoL/L Que、100μmoL/L Que進(jìn)行處理TPC-1細(xì)胞;Que-H+shRNA NC組、Que-H+SOCS3 shRNA組分別利用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑盒將shRNA NC、SOCS3 shRNA分別轉(zhuǎn)染至TPC-1細(xì)胞,48h后以100 μmoL/L Que處理TPC-1細(xì)胞,其中對(duì)照組不經(jīng)任何處理。

1.4CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖:將TPC-1細(xì)胞種植在96孔板(2×103個(gè)/每孔),每組包括六個(gè)重復(fù),在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育48h后,加入CCK-8試劑,檢測(cè)細(xì)胞在450nm的吸光度,計(jì)算增殖率變化。

1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡:取生長(zhǎng)狀態(tài)較好的TPC-1細(xì)胞,用預(yù)冷的PBS洗滌,然后與碘化丙錠(PI)和異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V在冰上孵育15min,使用FloMax軟件通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡率。

1.6Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移、侵襲:將TPC-1細(xì)胞以1×104個(gè)細(xì)胞/每孔的密度在24孔板中培養(yǎng)。將細(xì)胞用不含血清培養(yǎng)基稀釋,并接種到Transwell上室(其中遷移實(shí)驗(yàn)中Transwell上室不含Matrigel基質(zhì)膠;侵襲實(shí)驗(yàn)需預(yù)先涂Matrigel基質(zhì)膠),將含有20% FBS的RPMI 1640加入到Transwell下室中作為化學(xué)引誘劑。48h后,細(xì)胞侵入過(guò)濾器的下表面,并用乙醇固定30min,用0.1%結(jié)晶紫對(duì)細(xì)胞染色10min,并使用X71倒置顯微鏡在隨機(jī)選擇的五個(gè)視野中計(jì)算遷移與侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.7qRT-PCR檢測(cè)SOCS3、STAT3 mRNA表達(dá)水平:使用RNA TRIzol試劑提取細(xì)胞中的RNA,并使用prime script RT試劑盒按照說(shuō)明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,使用TB Green Premix Ex Taq Ⅱ進(jìn)行擴(kuò)增。mRNA的相對(duì)表達(dá)水平用2-△△Ct法計(jì)算,并以β-actin為標(biāo)準(zhǔn)。SOCS3上游引物5'-3':GTCACCCACAGCAAGTTTCC,下游引物5'-3':TCCAGTAGAATCCGCTCTCC;STAT3上游引物5'-3':CATATGCGGCCAGCAAAGAA,下游引物5'-3'ATACCTGCTCTGAAGAAACT;β-actin上游引物5'-3':CAGCCATGTACGTTGCTATCCA,下游引物5'-3':TCACCGGAGTCCATCACGAT。

1.8Western blot檢測(cè)細(xì)胞中SOCS3、p-STAT3、STAT3、p-JAK、JAK蛋白表達(dá)水平:在冰上用含有蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液裂解細(xì)胞,通過(guò)使用BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒進(jìn)行蛋白質(zhì)的定量,將等量的蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS/PAGE分離并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,封閉膜后,分別依次與SOCS3、p-STAT3、STAT3、p-JAK2、JAK2一抗孵育,依次加入合適的二抗再次孵育,然后用ECL檢測(cè)試劑檢測(cè)可視化蛋白,以β-actin用作內(nèi)部對(duì)照,通過(guò)ImageJ軟件分析條帶強(qiáng)度,定量蛋白表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1Que對(duì)各組TPC-1細(xì)胞增殖變化的影響:與對(duì)照組相比,Que-L組、Que-M組、Que-H組TPC-1細(xì)胞增殖率顯著下降(P<0.05);與Que-H+shRNA NC組相比,Que-H+SOCS3 shRNA組細(xì)胞增殖率顯著增加(P<0.05),見(jiàn)表1。

表1 各組細(xì)胞中增殖率變化的比較

2.2Que對(duì)各組TPC-1細(xì)胞凋亡變化的影響:與對(duì)照組相比,Que-L組、Que-M組、Que-H組TPC-1細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05);與Que-H+shRNA NC組相比,Que-H+SOCS3 shRNA組細(xì)胞凋亡率顯著下降(P<0.05),見(jiàn)圖1、表2。

圖1 觀察TPC-1細(xì)胞凋亡變化

表2 各組細(xì)胞中凋亡率變化的比較

2.3Que對(duì)各組TPC-1細(xì)胞侵襲、遷移變化的影響:與對(duì)照組相比,Que-L組、Que-M組、Que-H組TPC-1細(xì)胞侵襲、遷移數(shù)顯著下降(P<0.05);與Que-H+shRNA NC組相比,Que-H+SOCS3 shRNA組細(xì)胞侵襲、遷移數(shù)顯著增加(P<0.05),見(jiàn)圖2、3,表3。

圖2 觀察TPC-1細(xì)胞侵襲變化(×100)

圖3 觀察TPC-1細(xì)胞遷移變化(×100)

表3 各組TPC-1細(xì)胞中侵襲遷移變化的比較

2.4Que對(duì)各組TPC-1細(xì)胞SOCS3、STAT3 mRNA表達(dá)水平的影響:與對(duì)照組相比,Que-L組、Que-M組、Que-H組TPC-1細(xì)胞SOCS3 mRNA表達(dá)顯著增加,STAT3 mRNA表達(dá)顯著下降(P<0.05);與Que-H+shRNA NC組相比,Que-H+SOCS3 shRNA組SOCS3 mRNA表達(dá)顯著下降,STAT3 mRNA表達(dá)顯著增加(P<0.05),見(jiàn)表4。

表4 各組TPC-1細(xì)胞中SOCS3 STAT3 mRNA表達(dá)水平的比較

2.5Que對(duì)各組TPC-1細(xì)胞SOCS3、p-STAT3、STAT3、p-JAK、JAK蛋白表達(dá)水平的影響:與對(duì)照組相比,Que-L組、Que-M組、Que-H組TPC-1細(xì)胞SOCS3蛋白表達(dá)顯著增加,p-STAT3/STAT3、p-JAK2/JAK2表達(dá)顯著下降(P<0.05);與Que-H+shRNA NC組相比,Que-H+SOCS3 shRNA組SOCS3蛋白表達(dá)顯著下降,p-STAT3/STAT3、p-JAK2/JAK2表達(dá)顯著增加(P<0.05),見(jiàn)圖4、表5。

圖4 TPC-1細(xì)胞中SOCS3、p-STAT3、STAT3、p-JAK2、JAK2蛋白表達(dá)(Western blot圖)

表5 各組TPC-1細(xì)胞中SOCS3 p-STAT3/STAT3 p-JAK2/JAK2表達(dá)的比較

3 討 論

目前手術(shù)切除是PTC的主要治療方法,輔以放射性碘治療、促甲狀腺激素抑制治療、局部放療和靶向藥物治療,但對(duì)于晚期PTC患者或失去手術(shù)機(jī)會(huì)的患者,選擇潛在有用的藥物勢(shì)在必行,因此研究其發(fā)病機(jī)理對(duì)開(kāi)發(fā)臨床有效藥物至關(guān)重要。

Que在國(guó)際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)上也被稱為2-(3,4-二羥基苯基)-3,5,7-三羥基色烯-4-酮或3,3,4,5,7-五羥基黃酮,是常見(jiàn)的黃酮類化合物,在日常食物中普遍存在,包括堅(jiān)果、種子、各種植物、蔬菜、水果、茶和紅酒,已有文獻(xiàn)證明Que具有抗真菌、抗氧化、細(xì)胞毒性、保肝和抗癌活性,Que對(duì)腫瘤細(xì)胞有特定的影響,而對(duì)正常和非轉(zhuǎn)化細(xì)胞沒(méi)有影響,因此近年來(lái)其抗腫瘤特性受到大家的關(guān)注[5]。本研究結(jié)果顯示,不同濃度的Que顯著抑制了TPC-1細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移,誘導(dǎo)了TPC-1細(xì)胞的凋亡,與其在直腸癌[5]中的作用一致,均呈現(xiàn)劑量依賴性,提示Que對(duì)TPC-1具有抗腫瘤特性。說(shuō)明在目前的濃度范圍內(nèi)Que的抗癌作用隨劑量的升高而增強(qiáng),但Que濃度大于100μmoL/L后是否還具有這樣的量效關(guān)系則不清楚,可能隨劑量的升高而下降,也可能隨劑量的升高而不變,都需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

JAK2和STAT3是細(xì)胞因子刺激的信號(hào)介質(zhì),當(dāng)JAK2被細(xì)胞因子受體磷酸化,磷酸化的JAK2激活轉(zhuǎn)錄因子STAT3并促進(jìn)核轉(zhuǎn)位,從而調(diào)節(jié)與增殖、分化和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)靶基因,其異常激活與多種腫瘤的進(jìn)展有關(guān)。但JAK2/STAT3信號(hào)通路的活性受到SOCS家族的抑制,尤其SOCS3對(duì)JAK2具有較高的親和力,是JAK2/STAT3信號(hào)通路最關(guān)鍵的負(fù)調(diào)節(jié)因子。本研究結(jié)果顯示,不同濃度的Que處理TPC-1細(xì)胞后,STAT3 mRNA、p-STAT3/STAT3、p-JAK2/JAK2表達(dá)顯著下降,SOCS3 mRNA及蛋白表達(dá)顯著增加,提示Que可抑制TPC-1細(xì)胞的惡性行為,可能與上調(diào)SOCS,抑制STAT3表達(dá)有關(guān),與Yu等[6]結(jié)果相吻合。既往研究顯示,SOCS3表達(dá)的升高及STAT3表達(dá)的降低可抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲并誘導(dǎo)凋亡[3,7]。推測(cè)Que可能通過(guò)激活SOCS3/STAT3信號(hào)通路發(fā)揮抗PTC功能。為進(jìn)一步驗(yàn)證該推測(cè),以SOCS3 shRNA進(jìn)行回復(fù)驗(yàn)證,結(jié)果發(fā)現(xiàn)SOCS3 shRNA逆轉(zhuǎn)了Que對(duì)TPC-1細(xì)胞的惡性行為的抑制作用,表明Que通過(guò)上調(diào)SOCS3表達(dá)并抑制JAK2和STAT3磷酸化來(lái)激活SOCS3/STAT3信號(hào)通路進(jìn)而抑制PTC細(xì)胞系TPC-1細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。研究發(fā)現(xiàn)Que可抑制JAK2/STAT3信號(hào)激活,通過(guò)提高Bcl-2 mRNA水平促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞凋亡[8]。STAT3過(guò)表達(dá)可增加直腸癌細(xì)胞活性和侵襲能力,Que能通過(guò)逆轉(zhuǎn)STAT3水平加速細(xì)胞凋亡[9]。故本研究推測(cè)Que通過(guò)激活SOCS3/STAT3信號(hào)通路促進(jìn)Bcl-2 mRNA表達(dá),進(jìn)而誘導(dǎo)TPC-1細(xì)胞凋亡,抑制增殖、遷移和侵襲。

綜上所述,Que可抑制TPC-1細(xì)胞增殖、侵襲及遷移,誘導(dǎo)其凋亡,可能通過(guò)激活SOCS3/STAT3信號(hào)通路實(shí)現(xiàn),但由于細(xì)胞單一,作用機(jī)制復(fù)雜,仍需進(jìn)一步探索,為Que治療PTC提供有利依據(jù)。