黃芪多糖對MC-3T3-E1成骨細胞增殖的影響及作用機制研究

王劉玉,萬全會,陳軍

(南陽市第二人民醫院,河南 南陽 473003)

骨質疏松癥是以骨量丟失、骨微結構破壞為特征的臨床常見骨病,骨質疏松癥患者骨骼脆性的增加會使骨折風險增加,不僅影響患者的生活質量,也增加了家庭和社會的經濟負擔。骨質疏松癥的發病涉及多因素、多環節、多機制,其中成骨細胞的增殖和分化受到抑制是造成骨量丟失、骨微結構破壞的重要環節[1-2]。因此,調節成骨細胞增殖和分化也被認為是治療骨質疏松癥的重要研究方向。近年來,中藥湯劑在骨質疏松癥治療中的價值受到了越來越多的關注。黃芪是具有補氣升陽、益衛固表作用的一味中藥,是多種具有補骨作用的中藥方劑的重要組成藥物[3-6]。黃芪多糖是黃芪中的多糖類活性成分,相關研究發現黃芪多糖能夠促進間充質干細胞的成骨分化[7],調控成骨細胞中維生素D受體、1α-羥化酶、24-羥化酶的表達[8-9]。為了進一步探討黃芪多糖對成骨細胞增殖的影響及作用機制,我們以MC-3T3-E1成骨細胞為實驗對象進行了相關研究,現總結報告如下。

1 材料與儀器

1.1 實驗材料MC-3T3-E1成骨細胞,購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

1.2 實驗試劑DMEM培養基、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)購自美國Hyclone公司,黃芪多糖、腺苷一磷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)抑制劑Compound C(美國Sigma公司),MTS細胞活力檢測試劑盒(美國Promega公司),放射免疫沉淀法(radioimmunoprecipitation assay,RIPA)裂解液、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)試劑盒(上海碧云天生物科技公司),堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、骨鈣素(osteocalcin,OCN)、B淋巴細胞瘤-2(B-lymphoblastoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2-related X protein,BAX)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteine aspartic acid specific protease,Caspase)-3、磷酸化AMPK(phosphorylated AMPK,p-AMPK)、內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)一抗及辣根過氧化物酶標記免疫球蛋白G二抗(美國Abcam公司),增強型化學發光顯影液(美國Thermo公司)。

1.3 實驗儀器HERAcell 240型細胞培養箱(美國Thermo公司),Synergy LX型多功能酶標儀(美國BioTek公司),ChemiDoc MP化學顯影儀(美國Bio-Rad公司)。

2 方 法

2.1 MC-3T3-E1成骨細胞培養方法用含有10%FBS的DMEM培養基培養MC-3T3-E1成骨細胞,待細胞鋪滿培養瓶底面90%后,用胰蛋白酶進行消化,按照1∶3的比例進行傳代。傳代后的細胞繼續貼壁培養和消化傳代,收集第3代細胞,接種于培養板中進行分組及干預處理。

2.2 分組及干預方法將收集的第3代MC-3T3-E1成骨細胞,分別接種于96孔和12孔培養板,各接種25孔,各分為黃芪多糖低、中、高濃度組及黃芪多糖聯合抑制劑干預組、對照組,每組各5孔。黃芪多糖低、中、高濃度組分別用含有0.1 mol·L-1、1.0 mol·L-1、10 mol·L-1黃芪多糖的DMEM培養基進行培養,黃芪多糖聯合抑制劑干預組用含有10 mol·L-1黃芪多糖和10 μmol·L-1Compound C的DMEM培養基進行培養,對照組用DMEM培養基進行培養。

2.3 MC-3T3-E1成骨細胞增殖活力檢測方法培養24 h后,于96孔培養板內,分別加入20 μL MTS試劑,置于培養箱中繼續培養4 h。取出培養板后,充分震蕩,在酶標儀上測定各樣品于490 nm波長處的吸光值。

2.4 MC-3T3-E1成骨細胞增殖相關基因蛋白表達檢測方法培養24 h后,棄去12孔培養板內的培養基,加入RIPA裂解液裂解細胞,離心后提取總蛋白。采用BCA試劑盒測定總蛋白濃度,每個樣品取30 μg總蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳結束后,將凝膠上的蛋白濕轉至硝酸纖維素膜,用5%脫脂牛奶在室溫封閉2 h,加入ALP、OCN、Bcl-2、BAX、Caspase-3、p-AMPK、eNOS一抗,于4 ℃孵育過夜;洗膜后,加入辣根過氧化物酶標記免疫球蛋白G二抗,于室溫孵育2 h;加入增強型化學發光顯影液。于化學顯影儀中顯影、拍照,用imageJ軟件分析蛋白條帶灰度值,以β-肌動蛋白為參考,計算各蛋白的相對表達量。

2.5 數據統計方法采用SPSS20.0統計軟件對所得數據進行統計學分析。細胞增殖活力及ALP、OCN、Bcl-2、BAX、Caspase-3、p-AMPK、eNOS蛋白表達量的組間比較均采用單因素方差分析,組間兩兩比較均采用LSD-t檢驗;檢驗水準α=0.05。

3 結 果

3.1 MC-3T3-E1成骨細胞增殖活力檢測結果黃芪多糖低、中、高濃度組及黃芪多糖聯合抑制劑干預組、對照組細胞增殖活力比較,組間差異有統計學意義(0.59±0.06,0.71±0.08,0.97±0.14,0.60±0.07,0.41±0.06,F=28.832,P=0.000)。黃芪多糖低、中、高濃度組細胞增殖活力及黃芪多糖聯合抑制劑干預組均大于對照組(LSD-t=4.743,P=0.002;LSD-t=6.708,P=0.000;LSD-t=8.221,P=0.000;LSD-t=4.608,P=0.002);黃芪多糖低濃度組細胞增殖活力與黃芪多糖聯合抑制劑干預組比較,差異無統計學意義(LSD-t=0.243,P=0.811),黃芪多糖中、高濃度組細胞增殖活力均大于黃芪多糖聯合抑制劑干預組(LSD-t=2.314,P=0.049;LSD-t=5.286,P=0.001);黃芪多糖低、中濃度組細胞增殖活力均小于黃芪多糖高濃度組(LSD-t=5.579,P=0.001;LSD-t=4.423,P=0.010);黃芪多糖低濃度組細胞增殖活力小于黃芪多糖中濃度組(LSD-t=2.683,P=0.028)。

3.2 MC-3T3-E1成骨細胞成骨標志基因蛋白表達檢測結果5組細胞ALP、OCN的蛋白表達量比較,組間差異均有統計學意義。黃芪多糖低、中、高濃度組細胞ALP、OCN的蛋白表達量均高于對照組(ALP:LSD-t=3.528,P=0.008;LSD-t=4.417,P=0.002;LSD-t=6.822,P=0.000;OCN:LSD-t=3.153,P=0.014;LSD-t=6.485,P=0.000;LSD-t=6.543,P=0.000)和黃芪多糖聯合抑制劑干預組(ALP:LSD-t=2.414,P=0.042;LSD-t=3.155,P=0.013;LSD-t=5.892,P=0.000;OCN:LSD-t=2.339,P=0.047;LSD-t=5.926,P=0.000;LSD-t=14.546,P=0.000),黃芪多糖聯合抑制劑干預組細胞ALP、OCN的蛋白表達量與對照組比較,差異均無統計學意義(LSD-t=1.186,P=0.270;LSD-t=1.145,P=0.285);黃芪多糖低、中濃度組細胞ALP、OCN的蛋白表達量均低于黃芪多糖高濃度組(ALP:LSD-t=3.727,P=0.006;LSD-t=3.702,P=0.006;OCN:LSD-t=4.737,P=0.001;LSD-t=2.625,P=0.031);黃芪多糖低濃度組細胞ALP的蛋白表達量與黃芪多糖中濃度組比較,差異無統計學意義(LSD-t=0.392,P=0.705),黃芪多糖低濃度組細胞OCN的蛋白表達量低于黃芪多糖中濃度組(LSD-t=3.366,P=0.010)。見圖1、表1。

表1 5組MC-3T3-E1成骨細胞成骨標志基因蛋白相對表達量

注:ALP為堿性磷酸酶,OCN為骨鈣素,β-actin為β-肌動蛋白,①為對照組,②為黃芪多糖低濃度組,③為黃芪多糖中濃度組,④為黃芪多糖高濃度組,⑤為黃芪多糖聯合抑制劑干預組。

3.3 MC-3T3-E1成骨細胞線粒體凋亡途徑相關基因蛋白表達檢測結果5組細胞中Bcl-2、BAX、Caspase-3的蛋白表達量比較,組間差異均有統計學意義。黃芪多糖低濃度組、黃芪多糖聯合抑制劑干預組細胞Bcl-2的蛋白表達量與對照組比較,差異均無統計學意義(LSD-t=1.746,P=0.119;LSD-t=0.859,P=0.415),黃芪多糖中、高濃度組細胞Bcl-2的蛋白表達量均高于對照組(LSD-t=5.238,P=0.001;LSD-t=9.618,P=0.000)和黃芪多糖聯合抑制劑干預組(LSD-t=3.821,P=0.006;LSD-t=8.246,P=0.000);黃芪多糖低濃度組細胞Bcl-2的蛋白表達量與黃芪多糖聯合抑制劑干預組比較,差異無統計學意義(LSD-t=0.620,P=0.552);黃芪多糖低、中濃度組細胞Bcl-2的蛋白表達量均低于黃芪多糖高濃度組(LSD-t=8.875,P=0.001;LSD-t=6.102,P=0.000);黃芪多糖低濃度組細胞Bcl-2的蛋白表達量低于黃芪多糖中濃度組(LSD-t=3.953,P=0.004)。

黃芪多糖低濃度組細胞BAX的蛋白表達量與對照組比較,差異無統計學意義(LSD-t=1.881,P=0.097),Caspase-3的蛋白表達量低于對照組(LSD-t=2.907,P=0.020);黃芪多糖中、高濃度組細胞BAX、Caspase-3的蛋白表達量均低于對照組(BAX:LSD-t=5.285,P=0.001;LSD-t=7.340,P=0.000;Caspase-3:LSD-t=3.654,P=0.006;LSD-t=6.875,P=0.000)和黃芪多糖聯合抑制劑干預組(BAX:LSD-t=3.654,P=0.006;LSD-t=6.875,P=0.000;Caspase-3:LSD-t=2.940,P=0.019;LSD-t=6.314,P=0.000),黃芪多糖聯合抑制劑干預組細胞BAX、Caspase-3的蛋白表達量與對照組比較,差異均無統計學意義(LSD-t=1.053,P=0.323;LSD-t=0.714,P=0.496);黃芪多糖低濃度組細胞BAX的蛋白表達量均低于黃芪多糖聯合抑制劑干預組(LSD-t=3.253,P=0.012;),Caspase-3的蛋白表達量與黃芪多糖聯合抑制劑干預組比較,差異無統計學意義(LSD-t=2.212,P=0.058);黃芪多糖低、中濃度組細胞BAX、Caspase-3的蛋白表達量均高于黃芪多糖高濃度組(BAX:LSD-t=7.442,P=0.001;LSD-t=3.690,P=0.006;Caspase-3:LSD-t=4.496,P=0.002;LSD-t=4.642,P=0.002);黃芪多糖低濃度組細胞BAX的蛋白表達量高于黃芪多糖中濃度組(LSD-t=4.548,P=0.002),黃芪多糖低濃度組細胞Caspase-3的蛋白表達量與黃芪多糖中濃度組比較,差異無統計學意義(LSD-t=1.728,P=0.088)。見圖2、表2。

表2 5組MC-3T3-E1成骨細胞線粒體凋亡途徑相關基因蛋白相對表達量

注:Bcl-2為B淋巴細胞瘤-2,BAX為B淋巴細胞瘤-2相關X蛋白,Caspase-3為半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶,β-actin為β-肌動蛋白,①為對照組,②為黃芪多糖低濃度組,③為黃芪多糖中濃度組,④為黃芪多糖高濃度組,⑤為黃芪多糖聯合抑制劑干預組。

3.4 MC-3T3-E1成骨細胞AMPK/eNOS信號通路相關基因蛋白表達檢測結果5組細胞中p-AMPK、eNOS的蛋白表達量比較,組間差異均有統計學意義。黃芪多糖低、中、高濃度組細胞P-AMPK、eNOS的蛋白表達量均高于對照組(p-AMPK:LSD-t=3.082,P=0.015;LSD-t=4.546,P=0.002;LSD-t=5.064,P=0.001;eNOS:LSD-t=3.395,P=0.009;LSD-t=5.873,P=0.000;LSD-t=7.327,P=0.000)和黃芪多糖聯合抑制劑干預組(p-AMPK:LSD-t=5.819,P=0.000;LSD-t=6.731,P=0.000;LSD-t=6.961,P=0.000;eNOS:LSD-t=4.851,P=0.001;LSD-t=7.761,P=0.000;LSD-t=8.200,P=0.000),黃芪多糖聯合抑制劑干預組細胞p-AMPK、eNOS的蛋白表達量與對照組比較,差異均無統計學意義(LSD-t=1.893,P=0.095;LSD-t=1.455,P=0.184);黃芪多糖中、高濃度組細胞p-AMPK、eNOS的蛋白表達量均高于黃芪低糖高濃度組(p-AMPK:LSD-t=2.370,P=0.045;LSD-t=3.200,P=0.013;eNOS:LSD-t=2.910,P=0.020;LSD-t=4.985,P=0.001);黃芪多糖中濃度組細胞p-AMPK的蛋白表達量與黃芪多糖高濃度組比較,差異無統計學意義(LSD-t=1.048,P=0.325),黃芪多糖中濃度組細胞eNOS的蛋白表達量低于黃芪多糖高濃度組(LSD-t=2.564,P=0.033)。見圖3、表3。

表3 5組MC-3T3-E1成骨細胞磷酸化腺苷一磷酸活化蛋白激酶/內皮型一氧化氮合酶信號通路相關基因蛋白相對表達量

注:p-AMPK為磷酸化腺苷一磷酸活化蛋白激酶,eNOS為內皮型一氧化氮合酶,β-actin為β-肌動蛋白,①為對照組,②為黃芪多糖低濃度組,③為黃芪多糖中濃度組,④為黃芪多糖高濃度組,⑤為黃芪多糖聯合抑制劑干預組。

4 討 論

成骨細胞的分化和增殖受到抑制是骨質疏松發生和發展過程中的重要病理環節。成骨細胞參與骨形成過程,其正常的分化與增殖能夠保證機體的骨量及骨質量;而成骨細胞的分化和增殖受到抑制,則會導致機體骨量丟失、骨微結構改變,進而逐步發展為骨質疏松癥。黃芪是補腎壯骨湯、益腎補骨湯等用于治療骨質疏松癥中藥方劑中的君藥。黃芪多糖是中藥黃芪中的有效成分,具有促進細胞增殖、抑制炎癥反應、減少自由基生成等多種生物學作用[10-13]。有研究[7,14-15]發現,黃芪多糖能夠促進間充質干細胞的成骨分化。但對于黃芪多糖對成骨細胞增殖的影響尚未明確。我們采用不同濃度的黃芪多糖干預MC-3T3-E1成骨細胞,并檢測MC-3T3-E1成骨細胞的增殖活力,結果顯示,濃度為10 mol·L-1的黃芪多糖能夠顯著增強MC-3T3-E1成骨細胞的增殖活力,且MC-3T3-E1成骨細胞中成骨標志基因ALP及OCN的蛋白表達量隨黃芪多糖濃度升高而顯著增加。

成骨細胞增殖受到抑制與線粒體凋亡途徑的過度激活關系密切。線粒體釋放細胞色素C進入細胞漿,細胞色素C能夠通過一系列的級聯反應激活Caspase-3,進而誘發細胞凋亡[16]。BAX和Bcl-2是調控線粒體途徑凋亡的重要蛋白,BAX能通過促進線粒體釋放細胞色素C,進而誘發細胞凋亡;而Bcl-2則能夠拮抗BAX,抑制細胞色素C的釋放及線粒體凋亡途徑的激活[17-18]。相關研究發現,骨質疏松組織中Bcl-2的蛋白表達量減少,而BAX、Caspase-3的蛋白表達量升高[19-20]。我們研究發現,MC-3T3-E1成骨細胞Bcl-2的蛋白表達量隨黃芪多糖濃度升高而顯著增加,而BAX和Caspase-3的蛋白表達量隨黃芪多糖濃度升高而顯著降低。因此,黃芪多糖可能通過抑制成骨細胞中線粒體凋亡途徑的激活,進而減少成骨細胞凋亡。

AMPK/eNOS信號通路參與調控細胞的增殖和凋亡[21-22]。多項研究[23-25]發現,黃芪多糖能夠通過激活AMPK/eNOS信號通路減輕細胞損傷。我們分析了不同濃度黃芪多糖干預后MC-3T3-E1成骨細胞AMPK/eNOS信號通路相關基因的蛋白表達,結果顯示隨黃芪多糖濃度增加,MC-3T3-E1成骨細胞p-AMPK和eNOS的蛋白表達量顯著增加,提示黃芪多糖能夠促進成骨細胞中AMPK/eNOS信號通路的激活。為了進一步驗證AMPK/eNOS信號通路與黃芪多糖促進細胞增殖的關系,我們采用AMPK抑制劑Compound C聯合10 mol·L-1的黃芪多糖干預MC-3T3-E1成骨細胞,結果顯示,黃芪多糖聯合抑制劑干預組細胞中p-AMPK、eNOS的蛋白表達量低于黃芪多糖高濃度組,而細胞增殖活力小于黃芪多糖高濃度組,ALP、OCN、Bcl-2的蛋白表達量均低于黃芪多糖高濃度組,BAX、Caspase-3的蛋白表達量均高于黃芪多糖高濃度組。因此,我們認為黃芪多糖對成骨細胞增殖的調控作用依賴于AMPK/eNOS信號通路的激活。

本研究結果表明,黃芪多糖能夠促進MC-3T3-E1成骨細胞增殖,且該作用具有一定的濃度依賴性,其作用機制可能與調控線粒體凋亡途徑及AMPK/eNOS信號通路有關。