虛擬仿真軟件輔助液相色譜分離條件的綠色優化實驗

石志紅，邊剛，張紅醫，張博然

河北大學化學與環境科學學院，河北大學化學教學研究所，河北大學化學國家級實驗教學示范中心，河北 保定 071002

高效液相色譜法(HPLC)是一種分離分析技術，在工農業生產、環境監測、食品安全檢測等領域發揮著重要的作用[1]。它已成為高校化學及其相關專業儀器分析理論和實驗課程的重要教學內容[2]。然而，在HPLC的實驗教學中，與其他儀器分析實驗教學相似，存在如下共性問題[3]：第一，實驗內容基本不涉及實驗條件的優化，學生只能被動按照設定的實驗條件和步驟機械地完成實驗，不能發揮學生的主觀能動性；第二，大多數實驗教材中將實驗的條件、步驟都寫得一清二楚，學生在實驗過程中“照方抓藥”，其分析、解決實際問題的能力和創造力得不到培養和提高。

導致上述問題的原因可以歸結為以下兩個方面：一是“實驗時間延長”的制約。HPLC實驗條件優化花費時間相對較長，所以在有限的學時內很難安排色譜條件優化實驗。二是“化學廢液增加”的制約。HPLC的流動相多為乙腈、甲醇等有機溶劑，如果每位學生都開展HPLC條件優化實驗，勢必大量增加有機廢液，是與綠色分析化學要求背道而馳的，從經濟學角度考慮也會導致廢液處理支出的顯著增加。

為了使學生在進行HPLC實驗時既知其然也知其所以然，并且也不浪費太多的時間和試劑，基于虛擬仿真軟件的HPLC優化方法就是一條行之有效的解決途徑。很多研究機構和色譜工作者開發了各種色譜虛擬仿真軟件。其中一些商用軟件，比如Dry lab (Molnar-Institute)[4]和Chrom Sword (Iris Tech)[5]，由于價格昂貴，不利于推廣應用。而有些免費的色譜軟件，例如HPLC SIM需要在DOS系統下運行，HPLC Simulation需要在網頁下運行。這些軟件由于出現較早，在目前計算機軟件環境下運行效果不佳[6]。HPLC Teaching Assistant[7]是一款顯示軟件，它可以給出溶液的酸堿度、柱溫、等度洗脫、梯度洗脫等不同條件下的色譜分離結果，不過該軟件只能顯示非常有限的幾種物質的分離情況。

HPLC Simulator是一款免費的開放HPLC條件優化軟件，它是在明尼蘇達大學Peter Carr教授所創建的用于HPLC優化的Excel電子表格基礎上，由Paul Boswell和Dwight Stoll進一步發展成為單機版和web版本的HPLC條件優化模擬器[6]。作為一款簡單、易于操作的HPLC模擬器，與Dry lab和Chrom Sword等軟件相比，HPLC Simulator的突出優點就是作為免費軟件便于推廣應用。

同學們在掌握了簡單的液相色譜基本原理基礎上，能夠很輕松地操作HPLC Simulator。首先，通過網址http://www.hplcsimulator.org/simulator.php下載免費軟件。該軟件沒有使用時間限制，對計算機的操作系統也沒有限制，適用性更強。同時軟件在不斷更新，甚至在網站上就可以完成色譜條件優化過程[8]。需要注意的是：該軟件要求在Java環境下運行，在安裝好相應的Java版本之后，啟動該軟件便能夠使用。

在上述背景下，我們針對儀器分析實驗教學中涉及的色譜進樣操作實驗和高效液相色譜法檢測大黃蒽醌類化合物的實驗提出了一種改進方案：在不延長學時的前提下將二者有機地結合起來，創新性地引入基于HPLC Simulator軟件的色譜條件優化實驗環節，由學生分工合作完成實驗。實施路徑如下：(1) 明確分離目標；(2) 根據軟件模擬原理確定需要實驗獲得的參數；(3) 學生分組進行色譜預分離實驗；(4) 全體同學共享實驗數據，利用Origin軟件進行線性或非線性回歸獲得虛擬仿真參數，并加入到軟件數據庫中；(5) 通過虛擬仿真軟件實現HPLC分離條件的綠色優化，并將最優色譜條件輸出；(6) 根據軟件所給出的最優條件安排HPLC真實實驗加以驗證。

這樣的改進措施不僅可以使原本枯燥的色譜進樣操作練習轉化為目標明確的探索性實驗，而且可以使學生在諸多方面受益。首先，學生不僅可以掌握HPLC的基本操作，而且可以快速掌握HPLC分離條件優化方法；其次，學生利用虛擬仿真軟件輔助HPLC分離條件優化，增強了將信息技術與專業相結合的意識；第三，學生通過分工協作完成實驗，可以更好地培養團隊合作精神。更重要的是，為實際樣品的HPLC分離條件優化提供了新思路，增強了學生解決實際問題的能力。

1 實驗部分

1.1 實驗原理

HPLC Simulator在進行模擬前，需要在數據庫中添加待分離化合物。HPLC Simulator是一款開放的軟件，它可以在自身的20多種化合物數據庫的基礎上，允許用戶根據實際需要擴充數據庫中化合物的種類。成為HPLC Simulator數據庫的合格化合物需要有該化合物的四個參數：a'、b'、A'和B'。它們的計算公式如下：

式中k為溶質的保留因子，tR為保留時間，t0為死時間。Ф為流動相中有機改性劑的體積分數，S為溶質的溶劑強度參數，kw為純水作流動相時溶質的保留因子，T為溫度。S和kw均為與溫度有關的量。根據以上關系式，可以設計一系列實驗來獲取欲加入HPLC Simulator數據庫的化合物的a'、b'、A'和B'值。

固定色譜柱溫度T1，改變流動相Ф值分別為Ф11、Ф12、Ф13、Ф14和Ф15(下角標的第1個數字代表著溫度條件序號；下角標第2個數字代表著流動相體積分數序號)，進樣測定，記錄所對應的保留時間tR11、tR12、tR13、tR14和tR15。改變色譜柱溫度為T2、T3、T4和T5，繼續進行實驗，實驗安排如表1所示。

表1 獲取化合物的四個特征參數(a'、b'、A'和B')的實驗設計

將實驗獲得的tR數據代入公式(1)求出所對應的k，將Ф和對應的k代入方程(2)進行擬合，求出對應的lgkw和S。將T和相應的lgkw代入方程(3)進行擬合，求出a'和b'值。將T和對應的S代入方程(4)進行擬合，求出A'和B'值。

圖1為HPLC Simulator的主界面。該模擬器左側為工具欄，分為六個主要的板塊：① 流動相：可選擇水、乙腈等；流動相的比例；洗脫方式：選等度洗脫或梯度洗脫方式；② 繪圖選項：溶劑B的體積分數、背壓、流動相的粘度、待測組分的保留因子、待測組分在色譜柱中的位置；③ 色譜性能選項：溫度、進樣體積、流速、柱效、塔板高度、理論塔板數、背壓；④ 一般性能選項：洗脫劑的粘度、擴散系數、時間常數、信號漂移、噪聲、自動測定時間范圍、起始時間、終止時間、繪圖點；⑤ 色譜柱性能選項：固定相(類型、柱長、內徑、顆粒大小、顆粒間的尺寸、總孔隙度)、死體積、死時間、van Deemter方程選項(渦流擴散項系數、分子擴散項系數、傳質阻力項系數)、塔板高度；⑥ 其他選項：柱后管路(長度、內徑、體積)。

圖1 HPLC-Simulator軟件的主界面

模擬器的右側為圖像顯示區：根據色譜條件的變化，軟件能夠即刻繪制出待測物質的色譜峰，節約了探究色譜條件的時間，而且節省了大量的有機試劑，減少了對環境的污染，符合綠色化學的理念。在色譜圖的下方會顯示出待測物質的出峰時間、保留因子、峰寬等試驗結果。軟件也能夠對圖像區域進行簡單的放大和縮小，調整譜圖的范圍。

圖2為Add New Compound操作的主界面，將待分離化合物的a'和A'值填入intercept數值框，b'和B'值填入相應的slope數值框，就能在模擬器中顯示出該化合物的色譜圖。改變色譜條件，根據模擬器給出的色譜圖可對色譜分離條件不斷進行優化。

圖2 Add New Compound操作的主界面

1.2 試劑

蘆薈大黃素(97.5%)、大黃酸(99.3%)、大黃素(96.0%)、大黃酚(99.4%)和大黃素甲醚(99.2%)標準品(中國食品藥品檢定研究院)，甲醇(色譜純，邁瑞達試劑有限公司)、磷酸(分析純，梯希愛化成工業發展有限公司)。實驗用水為二次蒸餾水。

1.3 儀器

LC-20AD高效液相色譜儀(島津，日本)，配有SPD-20A紫外/可見分光光度檢測器，Rheodyne7725i手動進樣閥(美國)，LC solution Lite工作站和AT-330色譜柱恒溫箱(天津市奧特賽恩斯儀器有限公司)。EX125DZH分析天平(精度0.01 mg，常州奧豪斯儀器有限公司)。

色譜條件：色譜柱：Hubble反相C18柱(150 mm × 4.6 mm，5.0 μm，Omni公司)；流動相：溶劑A，0.1%磷酸水溶液(V/V)；溶劑B，甲醇；流速1 mL·min-1；柱溫30 °C；檢測波長254 nm；進樣量5 μL。

1.4 實驗步驟

1.4.1 大黃蒽醌類化合物標準溶液的配制

精密稱定大黃蒽醌類化合物標準品，用甲醇溶解配制成濃度為100 μg·mL-1的標準儲備液，實驗前取標準儲備液用甲醇稀釋制備成濃度為5 μg·mL-1的標準工作液。

1.4.2 大黃蒽醌類化合物預分離實驗

按照表1具體安排色譜預分離實驗，其中T1、T2、T3、T4和T5分別設為27、30、35、40和45 °C。甲醇的Φ值分別設為80%、83%、85%、87%和90%。每位同學認領一個實驗條件，平行進樣3次，得到大黃蒽醌類化合物的保留時間數據，使用同一臺高效液相色譜儀的同學共享保留時間數據。

1.4.3 數據擬合求出a'、b'、A'和B'值

將預分離實驗所獲得的保留時間數據代入方程(1)計算出保留因子k，然后將k和流動相中有機改性劑的體積分數Ф代入方程(2)進行擬合，求出對應的lgkw和S。最后根據方程(3)和(4)進行擬合，求出a'、b'、A'和B'值。

1.4.4 HPLC Simulator軟件模擬優化色譜條件

將各化合物的數值輸入HPLC Simulator，改變色譜條件，根據模擬器給出的色譜圖對色譜分離條件進行優化。

1.4.5 實驗驗證

在高效液相色譜儀上對HPLC Simulator軟件模擬優化的色譜條件進行實驗驗證。

2 結果與討論

2.1 HPLC Simulator對大黃蒽醌類化合物色譜分離條件的優化

2.1.1 將大黃蒽醌類化合物的相關數據添加到軟件數據庫中

由于HPLC Simulator在進行模擬前，需要在數據庫中添加待分離化合物。作為合格入庫化合物必須提供a'、b'、A'和B'四個參數。按照表1的設計進行實驗，將獲得的數據代入方程(2)進行擬合，求出對應的lgkw和S。最后代入方程(3)和(4)進行擬合，求出a'、b'、A'和B'值。表2列出了五種大黃蒽醌類化合物在不同溫度下的lgkw和S值，表3列出了最終獲得的五種大黃蒽醌類化合物的a'、b'、A'和B'四個特征常數值。

表2 五種大黃蒽醌類化合物在不同溫度下的lgkw和S值

表3 五種大黃蒽醌類化合物的四個特征常數值

2.1.2 色譜分離條件的虛擬仿真優化

將大黃蒽醌類化合物的a'、b'、A'、B'數據填入HPLC Simulator模擬器中(如圖2所示)，這些化合物就成為數據庫中的合格化合物了。HPLC操作一般有兩種洗脫方式：等度洗脫和梯度洗脫。前者主要針對簡單混合物體系的分離，而后者主要是針對復雜混合物體系的分離，梯度洗脫往往具有更高的使用價值。為此，設定了a、b、c、d、e和f六個梯度洗脫程序，如表4所示。

表4 六種模擬的梯度洗脫條件

圖3為HPLC Simulator給出的模擬分離結果。在a和b的梯度條件下五種化合物的保留時間相對較長，而最后出峰的大黃素甲醚峰形寬且矮。在c、d、e、f的梯度洗脫條件下五種化合物能夠在10 min內完全分離，大黃素甲醚的色譜峰明顯變窄，色譜峰增高，有利于定性和定量分析，但最終選擇哪一個色譜分離條件應用于實際樣品分析，還要進行實驗驗證。

圖3 六種梯度條件下大黃蒽醌類化合物的HPLC Simulator模擬色譜圖

2.2 實驗驗證

HPLC Simulator軟件給出的分離條件是否可靠？為了回答這個問題，進行了驗證實驗。驗證實驗是在LC-20AD高效液相色譜儀(島津，日本)上完成的，梯度條件與表4相同。圖4為六種梯度條件下大黃蒽醌類化合物的實際色譜圖。對比圖3和圖4的結果可以發現：首先，對于五種化合物的保留順序，實驗結果與模擬結果完全一致。其次，五種化合物的保留時間隨流動相中甲醇含量變化的趨勢完全一致。再次，大黃素甲醚的色譜峰形隨流動相中甲醇含量變化的趨勢也完全一致。當然，我們可以觀察到：模擬色譜圖和實際色譜圖中相應色譜峰保留時間存在一定差異。這與色譜系統的死體積以及色譜柱的裝填情況等因素有關。從圖4可以看出，在實際分離中，a、b、c保留時間長，尤其a、b中大黃素甲醚的峰明顯變寬。而e和f中大黃酸與后面的雜質峰分離度不夠大，因此最終選擇d的梯度洗脫條件為最佳色譜分離條件用于大黃蒽醌類化合物的檢測。本文所確立的梯度洗脫方法總分離效果優于文獻[9]的方法，對于保留時間最長的大黃素甲醚，分析時間可控制在10 min以內，而文獻[9]中大黃素甲醚的分析時間接近34 min。

圖4 六種梯度條件下大黃蒽醌類化合物的實際色譜圖

3 教學組織實施

本科生“儀器分析實驗”共開設15個實驗，其中包括兩個液相色譜實驗。第3-7周開設“高效液相色譜儀結構、工作原理和操作技術練習”實驗，第13-17周開設“高效液相色譜法測定大黃蒽醌類化合物的含量”實驗，每個實驗4學時。以50人的班級為例，將學生分為五組，每組10人。儀器分析實驗課每次同時開設5個不同實驗，5組同學按照實驗運行表進行輪轉。在第3-7周，每周有一組同學進行“高效液相色譜儀結構、工作原理和操作技術練習”實驗，每5位同學共用一臺高效液相色譜儀。學生在上課之前要預習實驗，下載并練習HPLC Simulator軟件的使用。每周課上教師按照表1的設計將某個柱溫下的5種不同流動相配比的進樣實驗分配給共用同一臺儀器的5個學生，得到某個溫度下5種流動相組成時大黃蒽醌類化合物的保留時間。五周后五個溫度下的不同流動相比例對應的25個保留時間數據均已獲得。教師將收集匯總的保留時間數據共享給使用同一臺高效液相色譜儀的同學。學生課下進行HPLC Simulator軟件模擬，將軟件模擬結果附在實驗報告上提交。在第13-17周開設的“高效液相色譜法測定大黃蒽醌類化合物的含量”實驗中，學生對軟件模擬得到的最佳色譜條件進行實驗驗證，并進行大黃蒽醌類化合物的測定。對學習效果的評價從預習報告、課堂表現、實驗操作和實驗報告幾方面進行，各部分占比分別為10%、20%、40%和30%。這樣的改進措施和實驗安排使原本枯燥的色譜進樣操作練習轉化為目標明確的探索性實驗，大大激發了學生對色譜的學習興趣。通過課程的學習，學生不僅可以掌握HPLC的基本操作，而且可以快速掌握HPLC分離條件的優化方法。在使用HPLC Simulator軟件進行色譜條件模擬優化時，學生可以更直觀地了解影響柱效和分離度的各個因素，既知其然又知其所以然，改變了“照方抓藥式”的實驗課學習模式，為液相色譜初學者提供了更為豐富的學習體驗。

4 方法的可推廣性及局限性

方法的可推廣性體現在如下幾個方面：(1) 本文是將色譜進樣操作練習和大黃蒽醌類化合物的檢測實驗結合起來，增加了虛擬仿真軟件輔助色譜條件優化的教學內容。這種方式把原本枯燥的色譜進樣操作練習升華為目標明確的探索性實驗，調動了學生的學習積極性。這個方法可以推廣應用到其他化合物的液相色譜檢測實驗，無需延長學時，也不需要增加儀器設備。(2) HPLC Simulator是一款免費的軟件，這款軟件沒有使用時限，對計算機的操作系統也沒有限制，適用性強。軟件操作簡便、易于掌握，便于推廣應用。(3) 使用HPLC Simulator軟件模擬，可以使學生快速掌握色譜條件的優化方法，同時可以更直觀地了解影響柱效和分離度的各個因素，增強學生的學習效果。(4) 采用虛擬仿真軟件輔助液相色譜條件優化，減少了色譜流動相溶劑的使用和廢液的產生，符合綠色分析化學的發展趨勢，值得推廣。

方法的局限性在于：虛擬仿真軟件HPLC Simulator提供的流動相溶劑種類和色譜柱類型不夠多，有些情況需要近似處理。

5 結語

本文介紹了一種基于虛擬仿真軟件HPLC Simulator的液相色譜分離條件的綠色優化方法。將色譜進樣操作練習和大黃蒽醌類化合物的檢測實驗結合起來，在不延長學時的前提下，可以使學生在掌握HPLC基本操作的同時快速掌握HPLC分離條件優化方法。利用HPLC Simulator優化色譜條件省時省事節約溶劑，符合綠色化學理念。將本文介紹的方法應用于本科生實驗，可以增強學生將信息技術與專業學習相結合的意識。通過分工協作共享實驗數據可以更好地培養學生的團隊合作精神。