方寸之間，大放“光”彩
——介紹一個中級分析化學實驗

胡謙，李欣奕，袁野，韓旭，齊曉松，李嘉琦，郭艷莉，馬曉虎，劉偉

陜西師范大學化學化工學院，陜西省生命分析化學重點實驗室，西安 710119

1 引言

近年來，中級分析化學實驗已經在國內的一些院校開設[1]，我校也給本科生開設了中級分析化學實驗的選修課。由于中級分析化學實驗在大學三年級開設，學生已經學習了化學的四大基本學科，也具備了基本的實驗操作技巧，因此中級分析化學實驗的開展可以促進本科生化學綜合知識的應用，同時也能夠培養學生交叉融合的實驗能力。因此，本著這樣的理念，我們設計了一些與生活實踐相關的中級分析化學實驗，使同學們在融會貫通各門知識的基礎上，能夠真正具備解決問題的能力，從而培養學生的創新能力[2]。

本實驗利用化學發光檢測，設計了一種可以測定微量過氧化氫(H2O2)的紙分析芯片。H2O2是一種強氧化劑，其水溶液就是俗稱的雙氧水[3]。在日常生活中，H2O2的使用十分廣泛，其水溶液適用于醫用傷口消毒及環境和食品消毒。但H2O2同時具有一定的環境和健康危害，過量的H2O2會傷害人體的中樞神經。同時在生物代謝過程中，H2O2也是一種重要的信號物質[4]，體內過多的H2O2會導致氧化應激，因此測定微量的H2O2具有一定的研究意義。目前見到的微量H2O2的光學分析方法中，比色[5]、熒光[6]及化學發光[7]的方法均得到比較普遍的應用。而在光學分析方法中，化學發光方法[7]因其無需光源、靈敏度高和線性范圍寬的特點被廣泛應用于H2O2的檢測中。魯米諾-H2O2[8]體系是一個最基本的化學發光體系，在該體系中，H2O2是其基本的測定物質，所有能與H2O2發生直接或間接反應的物質均可用該體系進行測定。

基于以上的研究背景，在師范類院校中開展與化學發光有關的相關實驗可以促進師范類高校對于創新性人才的培養，同時也可以提高師范生的學科專業素養。因此結合本課題組在化學發光紙芯片上多年的研究，選取課題中比較前沿且研究完整的實驗，以微量H2O2的測定開展中級分析化學實驗。該實驗中，選擇具有大的比表面和化學發光催化活性的有機金屬框架(MOFs)材料[9]，作為魯米諾-H2O2體系的催化劑。利用1,3,5-均苯三甲酸(H3BTC)作為配體合成Cu-BTC，在紙芯片上結合Cu-BTC[10]對魯米諾-H2O2化學發光[11]體系的催化作用，可實現微量過氧化氫的測定。在該中級分析化學實驗的進行中，學生需要掌握有機化學的合成操作，簡易紙芯片的基本制作手段和反應釜的使用操作，同時還要熟悉化學發光儀的使用。在實驗開展之前，需要學生們自主進行文獻檢索和文獻閱讀，培養學生獨立閱讀文獻的能力和探究精神。實驗中遇到問題時，可以讓學生自主分析問題的產生原因，使動手能力和科研思維均得到鍛煉和提高，同時也可以培養師范生和非師范生的多方面能力。

2 實驗目的

(1) 掌握Cu-BTC材料的合成和紙芯片的制備方法及主要應用；

(2) 了解化學發光儀的原理，掌握其基本的操作方法；

(3) 掌握魯米諾-H2O2化學發光原理；

(4) 掌握H2O2濃度與發光強度的數學模型關系及數據處理方法。

3 實驗原理

紙芯片的概念最早由Whitesides提出，就是在一定尺寸的紙片上精細加工親、疏水通道，使分離及檢測等一系列工作[12]集成在紙上進行的微流控平臺。目前，紙芯片已廣泛應用于各種檢測方法中[13]。

近年來，MOFs的研究和應用得到了迅速發展。MOFs是由無機金屬中心與橋聯的有機配體通過自組裝相互連接的具有周期性網絡結構的多孔材料，因其具有穩定性、剛柔性、多孔性和性能的可設計性[9]，已被廣泛應用于催化[14]及氣體儲存與分離[15]等諸多領域。

Cu-BTC作為一種新型MOFs材料，具有良好的親水性能、多孔性和高孔容的骨架結構[10]。并且已見報道，Cu-BTC具有催化魯米諾-H2O2化學發光的作用[11]，與傳統的魯米諾體系的催化劑辣根過氧化物酶(HRP)相比，Cu-BTC受環境影響小，使用范圍廣。所以本實驗選擇Cu-BTC作為化學發光的催化劑，將Cu-BTC負載在紙芯片之上，結合常見的魯米諾-H2O2化學發光體系，在紙表面上完成了微量H2O2的測定。實驗原理圖如圖1所示。

圖1 紙芯片及實驗原理示意圖

4 試劑和儀器

4.1 反應試劑和材料

實驗中所需化學試劑和材料如表1所示。

表1 實驗中的試劑和材料

4.2 實驗儀器

本實驗使用到的小型儀器有試管、移液槍、注射器和鑷子，所需的大型儀器如表2所示。

表2 實驗用到的儀器

5 實驗步驟

5.1 紙芯片的制備

本實驗中首先需要制作實驗用的紙芯片載體。如圖1所示，采用紙切割機實現直徑為8 mm的圓形芯片的制作。然后將白色泡沫塑料溶解于三氯甲烷中，制備粘稠的疏水試劑[16]，裝于空的水彩筆內芯中，畫出直徑為6 mm的圓圈，這樣便制得具有疏水和親水區域的紙芯片。

5.2 Cu-BTC的制備

對于Cu-BTC的合成手段，本實驗中采用文獻[17]中的水熱合成的方案，具體的制備方法如下：

(1) 配制配體混合溶液。稱取試劑DMF (15 mL)，乙醇(15 mL)，并將DMF與乙醇按體積比1 : 1混合后，稱量固體1,3,5-均苯三甲酸(H3BTC) (1.0 g，4.8 mmol)，攪拌，使固體完全溶解。

(2) 配制0.57 mol·L-1的Cu(NO3)2水溶液。稱量固體Cu(NO3)2·3H2O (2.1 g，8.6 mmol)溶于15 mL H2O中。

(3) 混合溶液并反應。混合1和2中所得溶液并置于反應釜中，在100 °C下反應10 h。

(4) 離心及洗滌樣品。反應結束后，將反應釜內液體與藍色固體倒入離心管，離心。取出離心管，倒掉上清液，再加入適量DMF振搖，離心。操作重復兩次。最后加入乙醇振搖，離心，再倒掉上清液。

(5) 烘干樣品。將離心管置于真空烘箱內，在50 °C下烘干12 h，得到干燥的Cu-BTC固體。

5.3 魯米諾及過氧化氫儲備液的配制

1.0 × 10-2mol·L-1的魯米諾儲備液的配制：稱取0.18 g魯米諾，用0.10 mol·L-1的NaOH溶液溶解后轉入100 mL棕色容量瓶中，用超純水定容，避光保存一周后稀釋使用。

實驗用不同濃度的H2O2溶液由30%的H2O2溶液逐級稀釋得到。實驗前需要現用現配。

5.4 化學發光測定

打開MPI-B型多功能化學發光檢測儀及負高壓(測量高壓600 V)，暗盒關閉的情況下預熱30 min，使基線平穩。

將制得的Cu-BTC固體均勻分散在5.0 mL DMF試劑中，得到一定濃度的Cu-BTC催化劑溶液。向紙芯片上滴加2.5 μL新制備的2.6 mg·mL-1Cu-BTC催化劑溶液，待其干燥后置于化學發光儀暗盒中固定位置的載物臺上。化學發光儀上的暗盒關閉，通過暗盒上的小孔在充分避光的情況下，連接注射泵滴加2.0 μL的2.0 × 10-3mol·L-1魯米諾溶液于紙芯片之上；然后接著滴加2.0 μL的不同濃度的H2O2于紙芯片之上，用儀器自帶的化學發光軟件記錄化學發光相對強度信號。

5.5 最佳魯米諾和Cu-BTC濃度的選擇

進行H2O2測定前，選擇反應中最佳的魯米諾和Cu-BTC的濃度。保證滴加體積和量不變，選擇Cu-BTC的濃度時，在電子天平上稱量不同量的Cu-BTC固體，分散于5.0 mL DMF中，得到濃度為0.5-3.8 mg·mL-1的溶液。2.5 μL不同濃度的Cu-BTC滴加在紙芯片之上，后滴加2.0 × 10-3mol·L-1的魯米諾溶液和1.0 × 10-6mol·L-1H2O2，記錄化學發光信號值。

進行魯米諾最佳濃度選擇時，配制0.5 × 10-3-5.0 × 10-3mol·L-1的魯米諾溶液，固定Cu-BTC(2.6 mg·mL-1)和H2O2(1.0 × 10-6mol·L-1)濃度，按相同步驟操作，記錄化學發光信號值。

5.6 線性范圍和檢出限

在選定的實驗條件下，按照上述實驗步驟，測定不同濃度(1.0 × 10-4-1.0 × 10-8mol·L-1)的H2O2溶液濃度與發光強度的關系。以H2O2溶液濃度為橫坐標，以發光強度為縱坐標，繪制校準曲線。按照檢出限計算公式3δblank/k(δblank為空白信號標準偏差，k為校準曲線的斜率)計算檢出限。

6 結果與討論

6.1 Cu-BTC的表征

實驗初期，需要在反應釜中合成Cu-BTC。合成完畢后，對照文獻[17]找中合成的Cu-BTC，為了確認Cu-BTC的成功制備，通過X射線的粉末衍射分析(XRD)衍射峰位置以及場發射掃描電子顯微鏡(SEM)觀察其形貌，得到圖2的結果。從圖2A中可以看出，XRD的衍射峰出現在6.6°、9.4°和11.5°，與文獻[17]中報道的衍射峰一致。圖2B顯示，Cu-BTC的形貌呈現的是八面體型，該晶體結構也與文獻報道相符。

圖2 Cu-BTC的XRD (A)及SEM (B)圖

6.2 最佳魯米諾濃度

對于魯米諾-H2O2體系，為了提高H2O2檢測的準確性與顯著性，魯米諾的濃度高低會影響測定結果，因此，首先考察魯米諾濃度帶來的影響。在2.6 mg·mL-1的Cu-BTC-DMF溶液和1.0 × 10-6mol·L-1的H2O2溶液濃度時，室溫條件下，記錄0.5 × 10-3-5.0 × 10-3mol·L-1的魯米諾溶液產生的化學發光信號，結果如圖3所示。結果顯示，當濃度在2.0 × 10-3mol·L-1時有最佳效果，因此，選擇魯米諾溶液濃度為2.0 × 10-3mol·L-1。

圖3 魯米諾最佳濃度的選擇

6.3 最佳Cu-BTC濃度

為了在最佳條件下檢測H2O2，考慮其他因素可能造成的影響，Cu-BTC的濃度也需要優化。選擇2.0 × 10-3mol·L-1的魯米諾溶液和1.0 × 10-6mol·L-1的H2O2溶液濃度，在室溫條件下記錄0.5-3.8 mg·mL-1的Cu-BTC溶液產生的化學發光信號，得到結果如圖4所示。結果顯示，當濃度在2.6 mg·mL-1時擁有最佳效果，因此選擇Cu-BTC溶液濃度為2.6 mg·mL-1。

圖4 Cu-BTC紙上負載最佳量的選擇

6.4 過氧化氫的化學發光測定

在所選定的最佳條件下，測定不同濃度H2O2的化學發光信號值，結果表明，過氧化氫濃度在1.0 × 10-4-1.0 × 10-8mol·L-1內，呈現良好的線性趨勢，方程為I= 621.48lgC+ 5004 (R2= 0.9865)，I表示化學發光相對強度；C表示H2O2的濃度(mol·L-1)，如圖5A所示。同時，測定了H2O2濃度在1.0 × 10-8-1.0 × 10-7mol·L-1內的校準曲線(圖5B)，其線性回歸方程I= 63.96C+ 44.62 (R2= 0.9970)，其中I表示化學發光相對強度；C表示H2O2的濃度，單位為10-8mol·L-1。根據IUPAC規定的檢出限的計算公式，得到該方法檢出限為3 × 10-9mol·L-1。因此本方法能實現微量H2O2含量的測定。

圖5 不同濃度H2O2與化學發光信號圖(A)及校準曲線(B)

7 實驗組織及注意事項

中級分析化學實驗采用小班組授課和大循環上課模式，每組設置4-6名同學，分工協作具體的實驗操作和化學發光儀的使用和檢測工作。實驗共需要16 h，4個單元的實驗時間。前2單元的實驗主要是進行合成，后2單元進行相關的表征和過氧化氫的化學發光測定實驗。在實驗中采用大循環的小組合作模式，可以將MOFs的合成步驟與前一實驗的操作同時進行，即可合并2單元的實驗時間，大大提高實驗時間的利用效率。同時，本實驗中因需要使用反應釜，在實驗過程中需將實驗過程和步驟反復強化，并強調注意事項，提高學生的風險意識及加強對實驗安全性的正確引導。

本中級分析化學中存在以下注意事項：

(1) 在實驗過程中要注意做好個人防護，戴好口罩和手套。

(2) 在制備固體Cu-BTC的過程中，加入反應釜內的反應物不能超過釜體容積的四分之三；加熱容器如烘箱的溫度設置要按照操作規程嚴格進行；反應完成后務必使反應釜的溫度降至室溫時打開釜蓋。

(3) 在配制溶液時，過氧化氫溶液與Cu-BTC溶液需現配現用，魯米諾溶液的儲備液(1.0 × 10-2mol·L-1)需要提前配制并避光保存一周后方可稀釋使用。

(4) 在測定光信號的過程中，化學發光儀需要提前開啟，待基線穩定后再進行相關數據測定。在測定光信號時，需關緊儀器蓋并在實驗中嚴格避光。

8 結語

本實驗將MOFs合成于紙芯片之上，發展了一種紙上化學發光測定H2O2的中級分析化學實驗，有望實現實際樣品中微量H2O2含量的測定。由于中級分析化學實驗在大學三年級開設，學生已經具備了無機化學、分析化學、有機化學和物理化學的基本知識和實驗操作技巧，同時也具備了基本的數據統計能力，因此該實驗的開設對于提高學生的綜合實驗能力具有一定的意義。該實驗與生活實踐具有一定的聯系，為后續實現樣品中痕量過氧化氫含量的測定提供一定的研究思路，可以拓展本科生的科研興趣和視野，對于本科生開展后續的研究型實驗和本科畢業論文具有一定的推動作用，可促進教學研究的開展和培養學生的綜合及創新能力。