固相萃取技術在水果氨基酸分析前處理中的應用
——一個儀器分析綜合實驗

李積慧，韓健，陳建新

河北工業大學化工學院，天津 300401

高等教育是國家教育體系改革的助推器與學術創新的動力與源泉[1]。教育部“化學類本科教育質量標準”將培養具有創新意識和實踐能力的專業人才作為人才培養目標，將培養學生的動手能力、科學素養與創新能力為目的的實驗教學作為支撐目標實現的關鍵[2]。為響應國家人才發展戰略，開展結合科學探究的綜合性化學實驗成為化學教育工作者的努力方向[3-5]。

儀器分析是一門實踐性很強的課程。傳統的儀器分析以理論教學為主，配合相應的驗證實驗，促進學生對理論知識的理解。通常驗證實驗對象簡單，不涉及樣品前處理，與實際應用有明顯差距。為構建理論到實踐的橋梁，綜合性探究實驗被引入實驗教學[6-8]。通過綜合實驗，學生可以全面了解儀器分析從樣品采集、樣品前處理、定量分析到實驗數據處理整個分析過程，并在解決問題的實踐中培養學生嚴謹的科學態度和綜合思維能力。

1 實驗背景

為更好理解儀器分析的原理及其實際應用，設計了氨基酸分析儀分析水果中游離氨基酸的綜合性實驗，涉及水果中氨基酸的提取、富集、提取液脫色以及氨基酸測定等。本文以歐李鮮果為例，培養學生利用儀器分析解決實際問題的能力。歐李是我國北方特有的薔薇科櫻桃屬灌木果樹[9]。歐李果中含有多種微量氨基酸和維生素，用于果酒釀制具有特別的風味。同時，新鮮的歐李果漿液呈寶石紅色，是天然紅色素的重要來源[10]。利用色譜理論分析歐李果中多種游離氨基酸，需避免色素在儀器分析柱上的附著及對實驗結果的影響。因此，樣品中氨基酸分析過程中氨基酸提取、富集、色素去除決定了整個分析的準確度及工作效率。

2 教學目標與實驗設計

在掌握分析化學、物理化學以及樣品前處理知識的基礎上，儀器分析綜合實驗面向本校應用化學專業大三本科生開設。實驗安排12個學時，分為三個模塊，涉及氨基酸理化性質、色譜分離理論、固相萃取、光譜分析等知識。實驗的教學目標為：

(1) 通過氨基酸的提取及樣品前處理實驗鞏固學生色譜理論及樣品前處理知識，幫助學生了解儀器分析的全過程；

(2) 以實際樣品為例提高學生利用色譜知識解決實際問題的能力，培養學生的動手能力和嚴謹的科學態度；

(3) 在解決樣品凈化、富集等問題的過程中培養學生的綜合思維能力和科學素養。

為實現教學目標，實驗按照“樣品準備-氨基酸提取-樣品脫色-氨基酸分析-實驗數據處理”流程設計了以下實驗環節，并將實驗環節、知識運用以及學生能力培養相關聯。三者關系見表1。

3 實驗原理

實驗以色譜分離理論為基礎，用氨基酸分析儀測定歐李果中多種微量氨基酸。氨基酸分析前的提取、富集、脫色決定了實驗結果的準確性及工作效率。學生通過文獻查閱，選擇固相萃取技術作為歐李果中氨基酸測定前的處理方法。固相萃取是一種現代樣品前處理技術，具有綠色、高效的特點[11-13]。固相萃取技術基于固定相與樣品各組分間作用力不同實現樣品中不同組分分離，從而達到樣品中目標分析物與干擾組分分離的目的。為幫助學生更好地理解色譜分離及固相萃取理論，實驗選取強陰、陽離子、弱陰離子、弱極性及非極性固定相，考察不同極性的固相萃取柱與歐李色素及氨基酸間的不同作用，選取合適的固相萃取柱，去除色素干擾，保證氨基酸準確測定。

4 實驗部分

4.1 儀器與試劑

全自動氨基酸分析儀(L-8900，日本Hitachi)、紫外-可見分光光度計(UV-2700，日本島津)、高速冷凍離心機(德國Sigma3-18K)、固相萃取裝置(VAC ELUT SPS 24，美國Varian)、XW-80A渦旋混合儀、SHA-B數顯水浴恒溫振蕩器、101-1AB型電熱鼓風干燥箱、超聲波清洗器、電熱恒溫水浴鍋、勻漿機、電子分析天平、微波爐(800 W)。

無水乙醇、鹽酸、氫氧化鈉、甲醇、5-磺基水楊酸、納米羥基磷灰石等試劑均為分析純；高純氮(天津永騰氮氣廠)；茚三酮、乙二醇甲醚、冰乙酸、醋酸鈉、檸檬酸、檸檬酸鈉、無水乙醇、氯化鈉、氫氧化鈉等試劑均為色譜純，用于氨基酸分析儀的流動相制備。同時實驗用到多種不同極性的固相萃取柱。

4.2 樣品中游離氨基酸的提取

4.2.1 樣品準備

將歐李果洗凈，吸干表面水分、去核。稱重后倒入勻漿機中，加等量的水勻漿1 min，得到均勻的果肉漿液，倒入燒杯，封膜保存，冷藏備用。

4.2.2 游離氨基酸提取條件選擇

準確稱取準備好的歐李漿液約10 g，放入不同錐形瓶中，分別以HCl (0.1 mol·L-1)、水、乙醇(體積比1 : 1)為提取液，水浴振蕩、超聲、微波三種方式考察果漿中的游離氨基酸的提取方法。提取流程及條件見圖1。通過實驗結果對比，確定歐李果中氨基酸的提取方法及溶劑。

圖1 歐李中氨基酸的提取過程

4.2.3 氨基酸標準溶液的制備

氨基酸標準儲備液(2.5000 mmol·L-1)用0.02 mol·L-1的鹽酸分別稀釋成0.0100、0.0250、0.0500、0.0750、0.1000、0.1250 mmol·L-1的氨基酸標準混合溶液，用氨基酸分析儀分離測定，得到十七種氨基酸不同濃度下的峰面積。

4.3 樣品脫色處理

歐李氨基酸分析過程中，果肉的紅色素干擾實驗測定。為考察不同固相萃取柱對水果提取液中氨基酸的凈化作用，選擇強陽離子固相萃取柱(Waters Oasis Max Part)、強陰離子固相萃取柱(Waters Oasis Mcx Part)、弱陰離子固相萃取柱(AccuBond SPE AMIno cartridges)、弱極性氧化鋁柱(DIKMA ProElut AL-A)、弗羅里硅土柱(AccuBond SPE FLORISIL cartridges)、硅膠柱(DIKMA ProElut SI)、非極性C18柱(AccuBond SPE ODS-C18cartridges)、活性炭柱以及自制納米羥基磷灰石柱等九種固相萃取柱作為歐李氨基酸分析的前處理工具(依次編號1-9)。實驗前學生需確定上述固相萃取柱固定相的官能團，了解氨基酸與歐李色素的結構。采用色素保留模式，考察離子交換、弱極性、非極性作用對歐李果肉色素的去除及氨基酸測定的影響。通過實驗幫助學生理解不同分子間作用力對色素的去除能力。

4.3.1 固相萃取柱篩選

(1) 準確移取2 mL上述的歐李提取液，分別加樣到已活化的不同極性固相萃取柱；

(2) 收集濾液，比色，初步篩選出濾液為無色的固相萃取柱用于歐李果中氨基酸測定前的凈化；

(3) 篩選出的固相萃取柱用于氨基酸加標回收率實驗，考察其對氨基酸測定的影響。選擇氨基酸回收率高又具有色素去除能力的固相萃取柱用作歐李果中氨基酸分析前處理工具。

4.3.2 氨基酸回收率實驗

(1) 上述初篩出的固相萃取柱活化，4 mL低濃度氨基酸標液(0.0200 mmol·L-1)上樣，收集萃取液過濾(0.22 μm)，用氨基酸分析儀測試經固相萃取柱處理后氨基酸標準溶液的回收率。

(2) 選擇氨基酸回收率高的固相萃取柱進一步考察其對中濃度(0.0500 mmol·L-1)、高濃度(0.1000 mmol·L-1)氨基酸的回收率。

4.3.3 固相萃取柱脫色能力考察

選擇氨基酸回收率高的固相萃取柱進一步考察其脫色能力。準確移取2 mL上述歐李提取液用于固相萃取處理，得到的萃取液用分光光度計作光譜掃描，比較歐李提取液經不同固相萃取柱處理前后的光譜變化，從而判斷固相萃取柱的脫色能力。

5 結果與討論

5.1 氨基酸混合標準溶液的回歸曲線

由氨基酸混合標準溶液濃度與峰面積線性回歸得到十七種氨基酸的標準曲線(圖2)。十七種氨基酸的線性回歸系數R在0.9978-0.9999之間，表明十七種氨基酸溶液在0.0100-0.1250 mmol·L-1濃度范圍內線性良好，可用于微量氨基酸的定量。實驗幫助學生鞏固了儀器分析的外標定量法及數據處理。

圖2 十七種氨基酸的標準回歸曲線

5.2 游離氨基酸提取結果比較

三種提取方式下，不同溶劑提取歐李中游離氨基酸實驗結果見表2。比較結果表明，振蕩、超聲提取法測得氨基酸的百分含量優于微波提取。由于部分氨基酸在乙醇中的溶解度較差，水、鹽酸(0.1 mol·L-1)為提取液，多數氨基酸的提取效果優于乙醇提取液(乙醇與水的體積比為1 : 1)。綜合提取效果、溶劑成本、環境友好等因素，以水為提取溶劑，恒溫水浴振蕩作為歐李果肉中游離氨基酸的提取方式，保證游離氨基酸充分轉移到溶劑中。實驗過程幫助學生理解樣品中氨基酸提取原則和方法選擇。

表2 不同提取條件下歐李果中氨基酸測定結果

5.3 固相萃取柱的選擇

5.3.1 固相萃取條件初篩

樣品溶液經氧化鋁、弗羅里硅土及活性炭固相萃取柱處理后萃取液仍顯果肉提取液本來的寶石紅色。文獻調研發現，歐李紅色素為水溶性、酸性條件穩定的黃酮類花色苷類化合物[14]。盡管三種固定相均為多孔吸附材料，在酸性水溶劑條件下氧化鋁的羥基、弗羅里硅土的氧化鎂及硅羥基與中等極性色素間分子間作用力降低，非極性活性炭與極性色素分子間作用力弱，無法充分凈化樣品溶液。實驗幫助學生直觀理解不同極性固定相與色素間的作用力不同以及溶劑極性在固相萃取過程的影響。

其余六種固相萃取柱處理后的歐李提取液為無色，其對色素的去除能力及對氨基酸測定的影響需通過儀器進一步考察。

5.3.2 氨基酸回收率

為避免固相萃取處理對樣品氨基酸測定結果的影響，實驗用具有色素吸附能力的六種固相萃取柱處理氨基酸標準溶液(0.0200 mmol·L-1)，根據氨基酸的回收率，判斷不同固相萃取柱對氨基酸測定結果的影響。實驗結果見表3。

表3 氨基酸溶液經不同固相萃取柱處理后的回收率

回收率結果表明，氨基酸混合液通過1、3、6號固相萃取柱的回收率明顯降低，通過2、7、9號柱回收率較高。根據固相萃取理論，學生們共同探討產生上述結果的原因，總結如下：酸性條件下氨基酸的氨基官能團帶正電荷(-NH3+)，羧基(-COOH)基團未解離。1號強陽離子柱固定相在水溶劑中解離為帶負電荷的磺酸根離子(-SO3-)，與氨基酸分子間形成靜電作用，多種氨基酸被固相萃取柱保留；3號柱固定相的氨基官能團與帶正電荷的氨基酸官能團形成氫鍵，部分氨基酸與固相萃取柱間較強作用力導致其無法完全流出固相萃取柱；6號硅膠柱的硅羥基與氨基酸形成氫鍵，同樣不利于氨基酸流出固相萃取柱，導致氨基酸的回收率偏低。相反，2號陰離子柱固定相在水溶液中解離為帶正電荷的季銨鹽，與帶正電的氨基酸分子間存在靜電斥力，氨基酸在該柱上幾乎不保留，經該固相萃取柱處理的十七種氨基酸回收率均在95.47%-100.82%范圍內；7號C18柱的非極性固定相與氨基酸極性官能團間弱相互作用，對氨基酸測定影響小；9號強堿磷灰石柱固定相的層狀結構及少量羥基與氨基酸官能團有氫鍵作用，氨基酸通過該固相萃取柱的回收率低于2號柱及7號柱。實驗表明2號強陰離子柱、7號C18固相萃取柱對氨基酸測定結果影響較小。

為進一步驗證上述結論，分別選擇中濃度(0.0500 mmol·L-1)、高濃度(0.1000 mmol·L-1)氨基酸混合標樣，經C18柱、強陰離子固相萃取柱及納米羥基磷灰石柱處理，中濃度十七種氨基酸的回收率范圍分別為99.16%-102.40%、97.97%-101.48%及92.38%-101.61%；高濃度氨基酸的回收率范圍分別為99.59%-103.86%、98.42%-101.57%及80.42%-96.69%。比較高、中、低濃度氨基酸回收率結果表明，C18柱與強陰離子固相萃取柱對十七種氨基酸的回收率均明顯高于納米羥基磷灰石固相萃取柱。前兩種固相萃取柱用于含氨基酸樣品前處理對測定結果影響較小。

5.4 固相萃取柱對色素的吸附

在保證固相萃取處理對氨基酸測定結果影響最小的前提下，考察其對歐李果色素的去除能力。在可見光區(360-800 nm)，歐李提取液經三種固相萃取柱凈化后的吸收光譜與原溶液的吸收光譜比較見圖3。從下到上，強陰離子固相萃取柱處理后樣品溶液在可見光區無吸收，表明樣品中的紅色素被固相萃取柱完全去除；納米羥基磷灰石柱的脫色效果優于C18固相萃取柱，溶液中仍有少部分色素殘留；C18固相萃取柱處理后樣品溶液的吸收光譜比原溶液的光譜有明顯下降，但仍有較強的吸收峰，表明該固相萃取柱不能充分凈化樣品中的色素。因此，選擇強陰離子固相萃取柱用于歐李溶液的前處理，既能保證氨基酸測定結果的準確性，又能徹底去除溶液中紅色素對測定的干擾。

圖3 經不同固相萃取柱凈化后歐李提取液的吸收光譜圖

探究三種不同極性固相萃取柱對色素保留的原因，酸性條件下，強陰離子固定相的季銨鹽帶正電荷，與黃酮類花色苷的多羥基形成強的氫鍵作用，從而充分富集歐李提取液中的紅色素；羥基磷灰石(Ca10(PO4)6(OH)2)的羥基同樣能與色素的羥基形成氫鍵，但羥基磷灰石分子中羥基較少，與色素間作用力較弱，導致少量色素不能被固相萃取柱保留；而C18固相萃取柱為非極性固定相，在極性溶劑中與極性色素的芳香環間存在疏水作用，導致部分色素被保留，提取液中仍存在色素殘留。

5.5 實驗收獲

通過歐李氨基酸分析綜合實驗，學生了解了樣品分析的全過程，掌握了樣品分析前處理的基本原則——高回收率、過程簡單、綠色環保。在固相萃取柱的選擇過程中，學生體驗了不同極性固定相與氨基酸及色素分子間的庫侖力、氫鍵力、范德華力以及溶劑極性、pH對固相萃取分離的影響。實驗鞏固了學生的色譜理論知識，確定了樣品氨基酸分析的凈化方法。通過實驗數據比較確定樣品中氨基酸的提取條件，培養了學生嚴謹的學習態度和動手能力。在探索樣品前處理方法的過程中，學生們分析問題、解決問題的綜合能力得到提高，達成了實驗的教學目標。儀器分析綜合實驗的開設，幫助學生理解和運用分析化學理論知識，提升科學素養和實踐能力，為畢業論文開展奠定了基礎。實驗開設四年以來，學生獨立思考、解決問題的能力得到明顯提高。

6 結語

儀器分析綜合實驗是一次教學相長的實驗過程，學生作為主體體驗色譜分離理論與實際應用的緊密聯系，提高了他們參與實驗的積極性。教師在指導實驗的過程中感受到學生的學習主動性和創新能力，認識到給學生更多獨立思考空間的重要性。綜合實驗過程是培養學生獨立思考和形成綜合性思維的過程，學生在實驗中運用理論知識、提高實驗技能使個人綜合能力得到提升。為更好實現教學目標，教師需要盡可能挖掘身邊的實驗素材，合理地設計實驗，激發學生學習熱情，提升學生的綜合素質。