基于指示劑置換法的肝素含量測定
——推薦一個分析化學綜合設計性實驗

張自品，趙祖志

1 安徽中醫藥大學藥學院，合肥 230012

2 安徽醫科大學基礎醫學院，合肥 230032

分析化學是研究物質的組成和結構，確定物質在不同狀態和演變過程中化學成分、含量、時空分布和相互作用的測量科學。分析化學是一門實踐性和應用性很強的學科，實驗教學在其課程教學中占有重要地位，是培養學生創新能力的主要途徑。目前在分析化學實驗教學中設置的實驗項目主要是驗證性實驗，驗證性實驗可以培養學生熟練地掌握基礎知識、基本實驗技能以及加深對基本理論的理解。但在長期的實踐教學過程中我們深刻地意識到，現有的實驗教學對于培養學生獨立思考、解決實際問題能力，尤其是對于培養和訓練學生的科研素質和實踐創新能力是非常有限的。

2012年，教育部在《關于全面提高高等教育質量的若干意見》中提出，“探索拔尖創新人才培養模式，促進科研與教學活動，及時把科研成果轉化為教學內容”。近年來，隨著創新驅動發展戰略的逐步實施以及高等學校創新創業教育的深化改革，高校正在全面提升創新能力，高等教育工作者也在實踐中不斷探索如何將高校的科研平臺優勢轉化為教學優勢，利用科研反哺教學從而促進教學質量的提高，也符合國家對創新人才培養的要求[1-3]。因此，如何探索科研反哺教學的新途徑、新思路，培養學生科學素養與創新能力，是高校面臨的一個重要難題[4-6]。推進教學與科研緊密結合，將先進、前沿的科研成果轉化為適應基礎教育的本科實驗教學資源，推動教師把國際前沿學術進展和最新研究成果融入實驗課堂教學，是改革實驗教學體系和培養學生實踐探索能力和創新能力的重要措施。因此在開設驗證性實驗的基礎上，根據實際情況逐步開設基于科教融合的綜合設計性實驗，可以提高學生專業知識的綜合運用能力、創新實踐能力、分析和解決問題的能力，并且有助于培養學生的基本科學素養與團隊合作精神[7-9]。作者結合多年從事分析化學實驗的教學經驗，基于科研成果向教學實踐探索轉化的思路，對課題組科研成果進行篩選和提煉，將基于指示劑置換(indicator displacement assay，IDA)的肝素的分析新方法轉化為本科生綜合設計性實驗教學項目[10]。

肝素是一種荷大量負電荷的線性聚合糖胺多糖(結構式如圖1a所示)，自1935年起在臨床上被廣泛用作凝血相關疾病的預防和治療藥劑，尤其是用作手術中的抗凝血劑[11]。但長期和過量使用肝素會引起諸如出血、血小板減少等副作用，因此肝素的劑量需要嚴格的監控[12-14]。臨床上用于肝素定量檢測傳統的方法是基于凝血原理和機制的方法，諸如活化凝血時間法(ACT)、活化部分凝血活酶時間法(aPTT)、和凝血酶原時間(pTT)等[15-17]。這些方法具有耗時、價格昂貴、間接檢測、數據不可靠等缺點。針對肝素傳統分析方法的缺點，分析化學工作者們基于肝素的化學性質和特點設計合成了諸如主-客體復合物[18]、聚合物和多肽[19,20]、自組裝微納結構[21]等，結合各種分析信號讀出機制，建立了肝素的比色、UV-Vis光譜、和熒光、電化學等分析新方法。然而，這些方法大多不可避免地需要精巧復雜、耗時繁瑣的合成步驟，因而開發低成本、簡單快速、靈敏準確的肝素分析方法是十分必要的。

圖1 (a) 肝素、(b) MV2+和(c) pyranine的化學結構式

指示劑置換法(IDA)是一種基于分析物對指示劑進行競爭取代，根據取代前后指示劑信號的變化對分析物進行定量的分析方法。這種方法中，指示劑和受體分子可逆結合，由于分析物和受體的結合力大于指示劑和受體的結合力，因而在引入分析物的情況下，分析物會取代指示劑和受體結合從而引起指示劑信號的變化，因此利用指示劑信號的變化可以對分析物進行定量分析。基于IDA的分析方法無需復雜合成工藝和步驟，具有成本低、操作簡單、指示劑選擇靈活多樣、靈敏準確等優勢，近年來已逐步應用于分析和傳感領域[22]。作者課題組前期基于IDA的原理和技術，以甲基紫精(methyl viologen，MV2+，結構式見圖1b)作為肝素受體，以8-羥基芘-1,3,6-三磺酸三鈉鹽(pyranine，結構式見圖1c)作為光學指示劑，利用MV2+和肝素、pyranine之間結合的親和力不同，利用pyranine光譜信號(紫外-可見光譜吸收和熒光強度)的變化，實現了肝素的定量分析。本方法操作簡單、快速、結果可靠、成本低廉，適于血清、血漿以及肝素注射液中的肝素定量分析檢測[10]。

本文從分析化學的學科特點出發，基于科研與教學相互轉化、相互促進、科研反哺教學的理念，以及科研成果向教學實踐探索轉化的思路，結合作者多年從事分析化學實驗教學經驗，對課題組科研成果進行篩選和提煉，將基于IDA策略和技術的肝素分析新方法轉化為本科生綜合設計性實驗教學項目。選取該研究成果的紫外-可見光譜法部分的內容，將其設計成教學實驗。其難度適中，內容新穎，創新性和綜合性強，有利于培養學生的綜合素質和實踐創新能能力。

1 實驗目的

1) 鞏固紫外-可見分光光度法的理論知識，掌握紫外-可見光譜儀的基本操作。

2) 了解指示劑置換法的原理；理解基于pyranine-MV2+體系用紫外-可見光譜法測定肝素的原理和策略；理解分析原理和方法上的多樣性，了解分析化學新方法、新原理能夠為解決實際問題提供技術支撐。

3) 掌握實驗數據處理技能，理解分析化學中分析方法的線性、檢測限、靈敏度等概念；

4) 提高學生綜合運用知識能力、創新能力、實踐能力、獨立分析和解決問題的能力，以及培養學生的基本科學素養與團隊合作精神。

2 實驗原理

Pyranine是一種低毒、水溶性的有機光酸，在生理pH條件下荷負電，其結構如圖1c所示。Pyranine通常被認為是π電子給體，它在紫外-可見區具有較強的吸收，可以作為光學指示劑[23]。1,1-二甲基-4,4’-聯吡啶陽離子，又稱甲基紫精(MV2+)，其結構式如圖1b所示，通常被認為是π電子受體[24-26]。如圖2所示，pyranine和MV2+二者之間可以通過非共價作用結合生成pyranine-MV2+電荷轉移復合物(CT complex I)，該反應可在生理條件下快速完成，無需苛刻反應條件。正電荷的MV2+是肝素的有效受體，可以和肝素形成heparin-MV2+復合物(CT complex II)，并且MV2+和肝素結合的親和力大于和pyranine結合的親和力。因此，當向pyranine-MV2+體系中加入肝素后，肝素會迅速置換出pyranine而和MV2+結合生成CT complex II，從而使pyranine從pyranine-MV2+復合物中游離出來。像這種基于指示劑pyranine和受體MV2+以及分析物肝素之間的競爭作用原理的分析技術被稱為指示劑置換法。

圖2 基于pyranine-MV2+體系的肝素指示劑置換法的原理示意圖

我們前期的研究結果表明，Pyranine酚羥基pKa約為7.14，在水溶液中存在酚羥基的酸堿解離平衡。Pyraine酸式體和堿式體在紫外-可見區的最大吸收波長分別在405 nm和455 nm，在生理pH條件下(pH 7.4)，游離的pyranine吸收光譜如圖3黑線所示。相同條件下，往pyranine溶液中加入MV2+后，pyranine在405 nm的特征吸收峰顯著降低，同時455 nm處的特征吸收紅移至468 nm處，該結果表明二者生成了pyranine-MV2+復合物。而加入肝素至pyranine-MV2+體系后，體系則會立刻恢復pyranine的特征吸收，如圖3藍線所示。這是由于肝素-MV2+的結合親和力大于pyranine-MV2+結合親和力，肝素置換出pyranine。因而本實驗基于指示劑置換法的原理，以pyranine-MV2+溶液作為測試肝素的測試溶液，用溶液在405 nm處的吸光度對肝素進行定量測定。

圖3 基于pyranine-MV2+體系的指示劑置換法進行肝素定量分析的紫外-可見光譜驗證和表征

3 實驗部分

3.1 試劑與儀器

甲基紫精(MV2+，上海麥克林生化科技有限公司)，8-羥基芘-1,3,6-三磺酸鹽(pyranine)，肝素，葡萄糖、精氨酸、葡聚糖均購于阿拉丁試劑有限公司。牛血清白蛋白(BSA)，抗壞血酸(AA)，尿酸(UA)，三磷酸腺苷(ATP)，硫酸軟骨素(CHS)購置于國藥集團化學試劑有限公司，透明質酸購于上海源葉有限公司。25 mmol·L-1磷酸緩沖溶液(PBS)、25 mmol·L-1三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)緩沖溶液、25 mmol·L-14-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)緩沖溶液均由實驗前新鮮配制并用0.1 mol·L-1NaOH溶液調節至pH 7.4。實驗中所用試劑和藥品均至少為分析純。

紫外-可見光譜測試實驗采用Specord 205紫外-可見分光光度計(德國耶拿分析儀器股份公司)并配以1 cm石英比色皿采集紫外-可見吸收光譜，光譜波長掃描范圍為330-650 nm。采用移液槍進行測試樣品的配制和移取。

3.2 實際樣品處理

將成年雄性SD大鼠(200-250 g)隨機分為對照組(n= 3)和實驗組(n= 3)，經0.8%的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(40 mg·kg-1，i.p.)后麻醉。對照組和實驗組分別腹腔注射0.9%生理鹽水(10 mL·kg-1)和肝素(5000 U·kg-1)。給藥30 min后，兩組大鼠從腹主動脈取血，然后轉入含有所需量EDTA抗凝液的離心管中，3000 r·min-1離心15 min，所得血漿用于紫外-可見光譜測試。實驗結束后，實驗動物立即麻醉后斷頭處死。

3.3 實驗內容和實驗過程

3.3.1 實驗原理和策略的紫外-可見光譜驗證

以25 mmol·L-1HEPES緩沖溶液(pH 7.4)為空白溶液，在330-650 nm波長范圍內，采集背景光譜，再以含10 μmol·L-1pyranine、10 μmol·L-1pyranine + 50 μmol·L-1MV2+、10 μmol·L-1pyranine + 50 μmol·L-1MV2++ 50 U·mL-1肝素的25 mmol·L-1HEPES緩沖溶液(pH 7.4)為測試溶液分別采集測試溶液的樣品光譜。引導學生以pyranine的紫外-可見光譜為依據，判斷加入MV2+后生成pyranine-MV2+復合物，以及加入肝素進行指示劑置換后的紫外-可見光譜變化特點，從而理解指示劑置換法的原理和基于pranine-MV2+體系對肝素進行紫外-可見測定的原理和策略。

3.3.2 實驗條件的優化

(1) pyranine和MV2+濃度的選擇。

以25 mmol·L-1HEPES緩沖溶液(pH7.4)為空白溶液，在330-650 nm波長范圍內，采集背景光譜。固定pyranine為10 μmol·L-1，分別考察pyranine : MV2+濃度比為1 : 1、1 : 2、1 : 5以及1 : 10時，pyanine-MV2+體系對0、1、2、5、10、以及20 U·mL-1肝素的響應。并分別以不同濃度比的pyanine-MV2+在405 nm處的吸光度變化率ΔA/A對肝素的濃度作圖，進行線性擬合，從而比較不同pyranine : MV2+濃度比條件下對肝素響應信號的大小和響應的靈敏度來篩選pyranine : MV2+最佳濃度比，并能解釋二者濃度比影響方法分析性能的原因。這里吸光度變化率ΔA/A，ΔA為pyarnine-MV2+溶液在加入肝素后和未加入肝素時在405 nm處的吸光度之差，A為pyarnine-MV2+溶液在未加入肝素時在405處的吸光度。

(2) 緩沖溶液的選擇。

緩沖溶液的和荷電性質會影響負電荷肝素和正電荷的MV2+的相互作用，從而影響pyranine-MV2+體系對肝素的紫外-可見光譜響應，因而本實驗選用負電荷的PBS緩沖溶液、正電荷的Tris-HCl緩沖溶液，以及兩性緩沖溶液HEPES作為不同荷電性質的緩沖溶液的典型代表，考察不同緩沖溶液對方法分析性能的影響。分別以25 mmol·L-1，pH為7.4的PBS、Tris-HCl、和HEPES緩沖溶液為空白溶液采集背景光譜。再固定pyranine為10 μmol·L-1，根據(1)所獲得的pyranine : MV2+的最佳濃度比，分別考察在不同緩沖溶液中，pyranine-MV2+對0、1、2、5、10、20 U·mL-1肝素的響應。并分別以不同緩沖溶液下pyranine-MV2+在405 nm處的吸光度對肝素的濃度作圖，進行線性擬合，從而比較不同緩沖溶液條件下對肝素響應信號的大小和響應的靈敏度來篩選最佳緩沖溶液。

3.3.3 方法學考察

1) 線性。

根據3.3.2篩選的實驗條件，以25 mmol·L-1HEPES緩沖溶液(pH 7.4)為空白溶液采集背景光譜，以含有10 μmol·L-1pyranine和50 μmol·L-1MV2+的25 mmol·L-1HEPES緩沖溶液(pH 7.4)作為測試溶液，依次向測定溶液中加入一系列濃度的肝素，采集樣品光譜。以肝素濃度為橫坐標，以溶液在405 nm波長處的吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，確定該方法的線性范圍、建立線性方程。并理解分析方法的線性、靈敏度、檢測限概念。建議肝素濃度從0.1 U·mL-1開始逐漸增加到40 U·mL-1。整個實驗過程中，為降低測試溶液的稀釋因子和減小實驗誤差，要求滴加肝素溶液的體積不超過測試溶液體積的3%。因此實驗前需綜合考慮肝素儲備液的濃度以及移液槍的最小刻度等因素。

2) 選擇性。

根據3.3.2篩選的實驗條件，以25 mmol·L-1HEPES緩沖溶液(pH 7.4)為空白溶液采集背景光譜，以含有10 μmol·L-1pyranine和50 μmol·L-1MV2+的25 mmol·L-1HEPES緩沖溶液(pH 7.4)作為測試溶液采集樣品光譜后，再依次向測試溶液中加入1 mmol·L-1葡萄糖，50 μmol·L-1尿酸，50 μmol·L-1抗壞血酸、2 μmol·L-1多巴胺、2 μmol·L-15-羥色胺、0.1 mg·mL-1牛血清白蛋白、2 μmol·L-1精氨酸、10 μmol·L-1ATP、5 mg·mL-1透明質酸、0.5 mg·mL-1硫酸軟骨素，分別采集樣品光譜。根據測定溶液在加入上述物質后在405 nm處吸光度是否有明顯變化來確定這些物質是否對測定產生干擾。理解用該方法測定生理樣品時，需要考察哪些代表性內源性生理活性小分子和蛋白。思考并理解本實驗項目中為何需要考察正電荷和負電荷的內源性小分子以及肝素的結構類似物。

3.3.4 實際樣品的測定

對照組和給藥組SD大鼠血漿均用25 mmol·L-1HEPES緩沖溶液(pH 7.4)稀釋10倍后作為待測樣品。在3.3.2篩選的最佳實驗條件下，以25 mmol·L-1HEPES緩沖溶液(pH 7.4)采集背景光譜，配制2 mL含10 μmol·L-1pyranine-50 μmol·L-1MV2+的25 mmol·L-1HEPES (pH 7.4)緩沖溶液作為測試溶液，采集樣品光譜，再依次向測試溶液中先后加入10 μL對照組和給藥組大鼠血漿，分別采集樣品光譜。分別測定加入血漿樣品后405 nm處吸光度。實際樣品平行測定3次，根據3.3.3方法學考察中(1)線性中的線性方程計算對照組和給藥組大鼠血漿中的肝素濃度值。注意，計算時不要忽略了稀釋倍數。

3.4 主要實驗結果參考

根據我們前期的研究結果以及在小范圍推行的學生實驗結果，這里提供本實驗項目的主要實驗結果以供執行本實驗項目的老師和同學參考和借鑒。

1) Pyranine : MV2+最佳濃度比篩選結果。

固定pyranine濃度為10 μmol·L-1，考察不同pyranine : MV2+濃度比的條件下，以pyranine-MV2+體系在405 nm處吸光度對肝素在0.1-20 U·mL-1濃度范圍的響應，參考結果如圖4所示。結果表明，pyranine : MV2+濃度比在1 : 1-1 : 5之間時，隨著MV2+濃度的增加，pyranine-MV2+吸光度變化對肝素濃度響應的線性的斜率逐漸增大，表明體系對肝素檢測的靈敏度逐漸增加。而當MV2+濃度繼續增加時，即pyranine : MV2+濃度比小于1 : 5時，pyranine-MV2+體系對肝素檢測的靈敏度又開始逐漸下降。這是因為，MV2+濃度增加，由于形成了pyranine-MV2+CT complex I，降低了pyranine在405 nm處的吸光度，因而降低檢測肝素使的背景吸光度(如圖3所示)。背景信號的降低有利于提高靈敏度。當MV2+濃度太大時，又會增加肝素置換pyranine的難度，因而方法的靈敏度會下降。因此，推薦pyranine : MV2+為1 : 5為實驗的最佳濃度比。

圖4 不同pyranine : MV2+濃度比條件下，pyranine-MV2+體系在405 nm處的吸光度變化率對不同肝素濃度的響應

2) 緩沖溶液的選擇。

分別以含10 μmol·L-1pyranine + 50 μmol·L-1MV2+的濃度為25 mmol·L-1pH為7.4的PBS、Tris-HCl和HEPES緩沖溶液作為測試溶液測定其對0、1、2、5、10、以及20 U·mL-1肝素的響應，參考結果如圖5所示。結果表明在在HEPES緩沖溶液，體系對肝素的響應最靈敏，其線性的斜率0.0052 mL·U-1，而PBS和Tris-HCl條件下的斜率分別為0.0018和0.0033 mL·U-1。因此，推薦25 mmol·L-1pH 7.4的HEPES作為肝素測定的最佳緩沖。

圖5 不同緩沖溶液中pyranine-MV2+體系在405 nm處的吸光度變化率對不同肝素濃度的響應

4 教學安排與組織的建議

本實驗重點在于讓學生理解指示劑置換法測定陰離子的作用機制以及紫外-可見分光光度法定量分析的基本原理和方法；掌握對肝素進行定量分析的方法，以及學會對分析方法進行評價。

本實驗的實驗講義并沒有詳細的步驟，如何引導學生分工合作、自行設計方案驗證實驗方法的可行性、合理安排和利用課堂實驗時間、探索最佳條件，以及讓學生掌握本實驗數據處理的方法與步驟，是指導教師指導該實驗的核心內容。

建議在完成分析化學課程中化學分析和儀器分析理論課程以及相關實驗課程之后開設，或面向化學、藥學相關專業高年級本科生開設。可安排8-10學時，分2-3次實驗課完成。前4-6個學時主要任務和目的是實驗原理的驗證以及實驗條件的優化，后4個學時安排本方法的方法學考察以及實際樣品的測定。實驗課前布置檢索和閱讀本實驗相關的國內外文獻的任務，并于實驗開始前安排部分學生參與實驗準備，包括緩沖溶液的配制，pyranine、MV2+以及肝素儲備液的配制。

此外，關于實際樣品的測試，若具備條件，可以根據本實驗項目的實驗內容推薦，將SD大鼠分為對照組和給藥組，腹主動脈取血，血漿可以在實驗前準備好，冰箱冷藏備用。對于不具備動物實驗條件的學校或實驗室，實際樣品測定可以測定肝素鈉注射液或肝素鈉軟膏中肝素含量。

需要注意的是，本實驗中使用的甲基紫精是有毒藥品，實驗前須讓學生充分了解MV2+的規范和安全使用，實驗時須做好自身安全防護，需要帶護目鏡、乳膠手套或PE手套，按實驗室規范著裝并穿實驗服。

實驗項目結束后，撰寫小論文形式的實驗報告，并以小組為單位進行實驗結果PPT匯報和答辯，以培養學生的科技論文寫作能力和綜合表達能力。

5 結語

綜合設計性實驗可以激發學生的求知欲和創新意識，在實驗任務和目標的執行過程中可集中調動學生的認知基礎與實踐經驗，在培養實驗分析能力的同時，充分鍛煉思維的應變能力、整合能力和創新能力，促進學生的創造力，提高學生的科學素養和綜合素質。目前本實驗項目在我校藥學相關專業篩選報名的20名本科生中，作為分析化學綜合性研究性實驗項目首次開設，實驗包括實驗原理的驗證、實驗條件優化、定量檢測及實際樣品的分析，實驗教學效果良好。擬逐年優化，有計劃有步驟地面向我校藥學各專業本科生作為分析化學綜合性設計性實驗項目開設。該實驗項目既保證了實驗內容的前沿性與創新性，又無需昂貴的大型分析設備，無需復雜耗時的合成步驟，實驗操作簡便，是一項可以推廣的分析化學類綜合設計性實驗。本實驗項目可作為醫藥院校藥學相關專業、綜合類和師范類院校化學相關專業高年級本科生的分析化學、儀器分析綜合設計性實驗。