XRCC6基因多態性與術后化療胃癌患者預后的關系▲

陳 媛 李大鵬 成偉麗

(秦皇島市第四醫院胃腸腫瘤科,河北省秦皇島市 066000)

胃癌是臨床常見的惡性腫瘤,因起病隱匿,早期無典型癥狀,多數胃癌患者確診時病情已處于中晚期,手術治療效果差,病死率高[1],故化療在中晚期胃癌的治療中意義重大。如腫瘤對化療藥物產生耐藥,不僅影響治療效果,還會延誤病情[2]。因此,尋找能夠客觀、準確評估化療效果的生物標記物,對胃癌患者的化療效果及預后評估具有重要意義。

奧沙利鉑和順鉑等鉑類藥物是治療胃癌的常用藥物,此類藥物可通過鉑-DNA加合物靶向DNA,引起DNA畸變而調控DNA修復。若DNA修復功能受損可引起DNA不穩定,導致DNA鏈斷裂甚至細胞死亡,增加腫瘤的發生概率,但如果DNA修復能力過強,則會產生耐藥[3]。因此,有效控制DNA修復基因的修復功能是保證化療效果的重要前提。癌變細胞中X-射線修復交叉互補蛋白6(X-ray repair cross complementing 6,XRCC6)是人體重要的DNA修復酶,在腫瘤發生、發展中起到重要作用,但其在胃癌化療效果中的研究報告較少[4]。基于此,本研究通過檢測術后行奧沙利鉑+替吉奧化療方案治療的胃癌患者XRCC6基因的基因型分布頻率,分析XRCC6基因多態性與術后化療胃癌患者預后的關系,旨在為個體性化療方案的制訂,改善患者的化療效果及預后評估提供參考依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取我院2018年2—12月收治的99例胃癌患者作為研究對象,其中男性66例、女性33例,年齡28～83(55.32±3.26)歲。納入標準:經術后病理檢查確診為胃癌;臨床分期Ⅱ～Ⅲ期;年齡>18歲;均為在我院接受胃癌切除手術和術后化療治療的初治患者;臨床資料完整;患者或家屬知情且簽署知情同意書。排除標準:合并其他惡性腫瘤者;合并先天性免疫疾病或全身血液疾病者;認知障礙或精神疾病者;隨訪期間非疾病死亡或失訪的患者。本研究獲得我院醫學倫理委員會批準。

1.2 術后輔助化療方案 奧沙利鉑140 mg/m2(每周期第1天給藥)溶入500 mL 5%葡萄糖溶液中,靜脈滴注2～6 h;口服替吉奧膠囊40 mg/m2(每周期第1～14天給藥),2次/d。每個治療周期為21 d,共治療4個周期。

1.3 XRCC6基因rs2267437位點基因型的檢測方法 抽取患者入院時空腹外周靜脈血約3 mL,置于抗凝管內,以10 000 r/min離心5 min,去除上清液,采用酚-氯仿法常規提取血清DNA。PCR擴增的上游引物序列為5′-CTTCAGACCACTCTCTTCTC-3′,下游引物序列為5′-TCACCTCACAGTAGTCGTTG-3′。PCR反應體系共25 μL,包括DNA模板2 μL、PCR Master Mix [天根生化科技(北京)有限公司]12.5 μL、上游引物2 μL、下游引物2 μL、去離子水6.5 μL。反應條件為:95 ℃預變性4 min;95 ℃變性1 min,60 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min,共40個循環。使用Xmn Ⅰ限制性內切酶[生工生物工程(上海)股份有限公司]將PCR產物進行酶切反應,酶切反應體系總計20 μL,包括PCR產物7 μL、RE 10×Buffer 2 μL、乙酰化牛血清白蛋白0.2 μL、XmnⅠ 0.5 μL、去離子10.3 μL。37 ℃水浴30 min后將酶切產物加入瓊脂糖凝膠的負極加樣孔中,加入DNA Marker [天根生化科技(北京)有限公司]進行標記,以0.5×TBE進行電泳,接通恒壓恒流電泳儀,電壓3～6 V,電流20 mA,電泳時間約30 min,用ZE-7型手提式紫外檢測燈(上海寶山顧村電光儀器廠)觀察電泳情況,根據凝膠電泳結果中目的基因片段出現的情況判斷各等位基因和基因型的分布(見圖1),電泳判定rs2267437位點C、G等位基因產物大小分別為225 bp和230 bp。采用反向測序法對PCR產物進行測序,驗證XRCC6基因有CC、CG、GG 3種基因型和C、G兩種等位基因,其中CC型為野生純合型,CG型為突變雜合型,GG型為突變純合型。

圖1 酶切產物XRCC6基因rs2267437位點產物電泳圖

1.4 臨床病理資料的收集 收集患者的年齡、性別、吸煙情況(吸煙量為10支/d或吸煙1年以上為存在吸煙史)、飲酒情況(每月至少飲酒1次或飲酒半年以上為存在飲酒史)、腫瘤直徑、腫瘤部位、腫瘤浸潤深度、腫瘤臨床分期、遠處轉移情況、淋巴結轉移情況等臨床病理資料。

1.5 隨訪與分組 以電話、微信、門診等方式進行隨訪,隨訪內容為化療開始至化療36個月后胃癌患者的生存情況。根據存活情況,將患者分為存活組56例和死亡組43例。

1.6 統計學分析 采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析。計數資料以[n(%)]表示,組間比較采用χ2檢驗;采用COX回歸模型分析胃癌患者預后的影響因素。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 不同預后胃癌患者臨床病理特征的比較 兩組患者的腫瘤直徑、腫瘤臨床分期、遠處轉移情況、淋巴結轉移情況比較,差異均有統計學意義(均P<0.05);其中,死亡組腫瘤直徑>5 cm、腫瘤臨床分期為Ⅲ期、發生淋巴結轉移、存在遠處轉移的患者比例更高(均P<0.05)。見表1。

表1 不同預后胃癌患者臨床病理特征的比較[n(%)]

2.2 不同預后胃癌患者XRCC6基因的基因型分布頻率的比較 兩組患者的XRCC6基因的基因型分布頻率差異有統計學意義(χ2=11.468,P=0.003);其中,死亡組患者的XRCC6基因GG基因型、CG基因型的頻率均低于存活組(均P<0.05)。見表2。

表2 不同預后胃癌患者XRCC6基因的基因型分布頻率的比較[n(%)]

2.3 胃癌患者化療后預后影響因素的多因素COX回歸分析 以預后(1=死亡,0=存活)作為因變量,以腫瘤直徑(1=≥5 cm,0=<5 cm)、腫瘤臨床分期(1=Ⅲ期,0=Ⅱ期)、淋巴結轉移(1=是,0=否)、遠處轉移(1=是,0=否)、XRCC6基因的基因型(設置啞變量)作為自變量進行多因素COX回歸分析。結果顯示,腫瘤臨床分期為Ⅲ期、淋巴結轉移、遠處轉移是術后化療的胃癌患者預后不良的獨立危險因素(均P<0.05),而XRCC6基因突變情況是術后化療的胃癌患者預后不良的保護因素(P<0.05),見表3。

表3 多因素COX回歸分析

3 討 論

胃癌發病的分子機制尚不完全清楚,但癌基因突變被認為在腫瘤細胞侵襲、轉移過程中發揮重要作用[5]。化療是指藥物作用于腫瘤細胞而引起相關蛋白結構和功能改變,來抑制、殺死腫瘤細胞,進而控制疾病進展,但發生化療耐藥將大大降低化療的效果,嚴重影響患者預后[6]。修復酶的基因可通過單核苷酸多態性影響酶的結構和功能,進而導致個體出現化療耐藥[7],因此修復酶的結構和功能穩定是化療敏感的重要基礎。遺傳信息主要存在于DNA兩條脫氧核苷酸鏈中,雙鏈斷裂會破壞DNA完整性,進而導致DNA片段損傷[8]。核苷酸切除修復是雙鏈斷裂修復的重要途徑,修復酶相關基因所編碼的蛋白在修復雙鏈斷裂過程中具有重要的作用[9],因此,此類基因或可作為評估胃癌患者化療敏感性及預后的重要參考依據。

本研究結果顯示,術后化療的胃癌患者的預后可能與腫瘤直徑、腫瘤臨床分期、遠處轉移情況、淋巴結轉移情況、XRCC6基因突變有關(均P<0.05),多因素COX回歸分析結果顯示,經校正相關臨床病理特征后,XRCC6基因突變情況是術后化療的胃癌患者預后不良的保護因素(P<0.05),即攜帶XRCC6基因rs2267437位點CG/GG基因型的術后化療的胃癌患者預后更好,提示XRCC6基因發生雜合突變或純合突變更有利于術后化療胃癌患者的預后。鉑類藥物主要是通過破壞DNA發揮細胞毒性,進而導致DNA功能損傷來發揮抗腫瘤作用[10]。DNA修復增強可降低化療藥物的殺傷作用,進而影響化療效果,而DNA損傷后修復即是鉑類藥物發生耐藥的主要機制之一[11]。DNA修復是核苷酸通過識別受損DNA并進行片段切除,然后形成新DNA的過程,Ku70蛋白是在此修復過程中發揮重要作用的酶[12]。如核苷酸剪切修復功能降低,腫瘤細胞的DNA損傷后修復則受到抑制,進而腫瘤細胞增殖受阻,此時患者獲得較好的化療效果[13]。XRCC6基因編碼的Ku70蛋白可與Ku80結合以激活DNA蛋白激酶,開啟修復過程,而XRCC6基因rs2267437位點基因突變可影響Ku70蛋白表達,導致DNA雙鏈斷裂、修復途徑被抑制,進而導致DNA修復能力降低,抑制鉑類藥物化療耐藥發生,化療患者可獲得更好的預后[14]。此外,還有研究表明,XRCC6基因是調控雙鏈斷裂修復過程的重要分子,其發生突變后可通過影響核苷酸對DNA的修復作用,推測可能是XRCC6基因突變降低了核苷酸表達,進而影響了DNA修復功能,減少化療耐藥的發生,故患者預后更好[15]。 因此,攜帶XRCC6基因rs2267437位點CG/GG基因型的術后化療的胃癌患者預后更好。

綜上所述,XRCC6基因多態性與術后化療的胃癌患者的預后密切相關,攜帶XRCC6基因 rs2267437位點CG/GG基因型的術后化療的胃癌患者預后更好。臨床上可通過檢測XRCC6基因多態性,預測鉑類藥物化療應答效果,進而為個性化化療方案的制訂提供參考依據。然而本研究結論還有待擴大樣本進一步驗證,同時XRCC6基因多態性在胃癌化療耐藥中的作用機制也尚待深入挖掘。