膳食核苷酸對SAMP8小鼠肝纖維化的改善作用

韋嬋　王秀娟　劉睿　徐美虹　珠娜　樊蕊　李勇

摘要：目的：探討膳食核苷酸對SAMP8小鼠肝臟纖維化的改善作用。方法：采用SPF級SAMP8小鼠48只，按體重隨機分為正常對照組、核苷酸低劑量組、核苷酸中劑量組、核苷酸高劑量組，另取12只SAMR1小鼠作為模型對照組。正常對照組、模型對照組均采用基礎飼料進行喂養，核苷酸低、中、高劑量組采用額外添加0.3、0.6、1.2 g/kg核苷酸的基礎飼料進行喂養。所有組自3月齡開始干預，干預時長9個月。小鼠12月齡時，對小鼠肝組織進行HE染色觀察肝臟組織病理學結構，檢測肝臟羥脯氨酸、纖維化相關因子和氧化應激指標，同時選取正常對照組和核苷酸低劑量組進行轉錄組測序，對差異基因進行KEGG富集。結果：與模型對照組相比，正常對照組肝臟組織肝索結構紊亂，肝細胞排列不整齊，炎癥細胞浸潤。與正常對照組相比，膳食核苷酸顯著改善了增齡性肝臟纖維化程度，提高肝臟SOD、GSH-Px活力，降低肝臟脂質過氧化物MDA水平。核苷酸還顯著影響了細胞周期、氨基酸的生物合成和糖酵解/糖異生通路。結論：膳食核苷酸對SAMP8小鼠肝臟具有抗纖維化作用。

關鍵詞：肝纖維化;核苷酸;SAMP8小鼠;衰老預計到2050年，全球65歲以上的人口數量將從2010年的5.24億增加至15億[1]。全球人口老齡化逐步進展，人口老齡化及衰老相關疾病的高發已成為全世界面臨的重大社會和科學問題。衰老導致機體逐漸出現退行性變化。與此同時，隨著機體的衰老，衰老細胞逐漸積累，更會加劇機體發生與衰老相關的疾病。肝臟作為機體重要的代謝器官，也會發生結構和功能上的變化[2-3]，出現肝細胞排列紊亂、肝血竇明顯擴張、纖維化改變、緊密連接的通透性和通過細胞轉移的能力減少等。其中，肝纖維化是最重要的表現之一[4]。器官纖維化的發生不僅與衰老密切相關[5]，同時也是器官衰老的跡象[6]。隨著年齡的增長，實質細胞的再生能力逐漸下降，間質細胞增殖，分泌更多的細胞外基質，加重纖維化的發生。衰老通過阻礙細胞外基質重塑增強小鼠肝纖維化程度[7]。在很多肝臟疾病中，纖維化的易感性隨著年齡的增長而增加[8]。肝纖維化逐步進展會發展成為肝硬化，導致正常肝功能的損失，進而導致肝功能衰竭和死亡[9]；而因肝硬化死亡人數占全球死亡人數的2.2%，在死因排名中排名第11位[10]。改善衰老肝臟纖維化不僅可以提高肝臟健康與功能，也可以進一步延緩肝硬化的發生，故改善衰老肝臟纖維化對于健康具有重要的意義。

核苷酸作為生命本源物質，是體內生物過程的調節因子，對機體的生長發育、代謝、繁殖和遺傳起到重要作用。多代繁殖和終身喂養實驗證明，核苷酸是安全且可終身預防性服用，而且核苷酸有調節免疫力、抗感染、促進生長發育、調節腸道菌群功能、改善記憶和保護肝臟等多種生理功能[11]。研究也提示，核苷酸具有延緩衰老的作用[12]。此外，核苷酸可以改善酒精性肝損傷，預防酒精性肝損傷大鼠肝細胞脂肪變性[13]，具有很好的保肝作用。目前，關于核苷酸改善SAMP8小鼠肝纖維化的作用的文獻報道較少，故本研究以SAMP8雄性小鼠為實驗對象，采用膳食核苷酸對小鼠進行干預，通過測定肝組織羥脯氨酸明確膳食核苷酸對SAMP8小鼠肝纖維化的改善作用，同時測定纖維化相關因子和氧化應激指標，進行轉錄組測序，將差異基因進行KEGG富集探討膳食核苷酸改善SAMP8小鼠肝臟纖維化可能的機制，為核苷酸的功能開發和作用機制提供科學依據，也為改善肝臟狀態與功能提供可能的營養干預方案。

1材料與方法

1.1材料與儀器

核苷酸，白色粉末狀固體，是以蔗糖糖蜜為原料發酵，提取核糖核酸，采用酶解法生產分離得到，純度在99%以上。本研究使用的核苷酸由大連珍奧生物技術股份有限公司提供。基礎飼料，購自北京科澳協力飼料有限公司的大小鼠維持飼料。核苷酸干預飼料為在基礎飼料的基礎上以0.3、0.6、1.2 g/kg的比例額外添加核苷酸的飼料。

健康SPF級SAMP8小鼠和SAMR1小鼠，雄性，10～12 w齡，體重（25±10）g。由北京大學醫學部實驗動物中心提供。飼養于屏障級動物室，溫度范圍為 （22±2） ℃，相對濕度為 50%～60%，晝：夜明暗交替時間為12 h：12 h。實驗期間動物自由進食與飲水，動物單籠飼養。實驗動物許可證號：SYXK（京）2019-0015;實驗動物生產許可證號：SCXK（京）2021-0013。

羥脯氨酸測定試劑盒、總超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）測定試劑盒、丙二醛（MDA）測定試劑盒，南京建成生物科技；Anti-MMP2抗體、Goat Anti-Rabbit IgG、Anti-beta Actin antibody，Abcam（英國）；α-Smooth Muscle Actin （D4K9N） XP Rabbit mAb，CST（美國）。

1.2方法

1.2.1動物分組及處理SAMP8小鼠適應性喂養1 w后，共分為4組：正常對照組、核苷酸低劑量組、核苷酸中劑量組、核苷酸高劑量組；另取12只SAMR1小鼠作為模型對照組。采用不同飼料進行干預，正常對照組和模型對照組采用普通飼料進行干預，核苷酸低、中、高劑量組采用額外添加0.3、0.6、1.2 g/kg核苷酸的基礎飼料進行喂養。所有組均自3月齡開始干預，干預9個月。實驗過程中每周觀察各組小鼠的一般情況，包括毛色、精神狀態、攝食及日常活動情況等。12月齡進行相關指標的測定。

1.2.2HE染色實驗結束后使用頸椎脫臼法處死小鼠，分離肝臟，同一肝葉位置切去小塊肝組織置入4%甲醛緩沖液固定，使用二甲苯透明，石蠟浸泡后包埋，然后進行蘇木素染色和伊紅染色，最后使用光學顯微鏡觀察并拍照。

1.2.3羥脯氨酸和氧化應激指標測定采用試劑盒測定肝臟羥脯氨酸和氧化應激相關指標（SOD、GSH-Px、MDA）。

1.2.4Western Bolt取冷凍組織蛋白裂解液進行樣品制備，使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，最后電泳、轉膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育、顯色測定MMP-2、a-SMA蛋白表達量。

1.2.5轉錄組測序取肝臟組織進行RNA提取、PCR擴增、Illumina 測序、數據質量分析、篩選差異基因進行KEGG富集分析。

1.2.6統計方法正態及非正態分布的連續變量分別以平均數±標準差（x±s）表示；分類變量以個數（百分數）表示。采用SPSS 26.0軟件進行單因素方差分析，采用LSD法進行兩組間比較；方差不齊時采用Tamhane法進行post-hoc分析。P<0.05表示有統計學意義。

2結果和分析

2.1膳食核苷酸對小鼠肝臟組織病理學的影響

HE染色結果顯示，相比于模型對照組，正常對照組肝臟肝索結構紊亂、肝細胞排列不整齊、肝細胞水腫、核固縮。核苷酸低劑量組、核苷酸中劑量組和核苷酸高劑量組肝臟肝索結構排列整齊，肝細胞飽滿、肝細胞核正常（圖1）。

2.2膳食核苷酸對小鼠肝臟羥脯氨酸含量的影響

如表1所示，模型對照組肝臟羥脯氨酸含量低于正常對照組（P>0.05）。核苷酸低劑量組、核苷酸中劑量組和核苷酸高劑量組肝臟羥脯氨酸含量均顯著低于正常對照組（P<0.05）。這表明膳食核苷酸具有抗纖維化作用。

2.3膳食核苷酸對小鼠肝臟氧化應激指標的影響

如表2所示，核苷酸低、中、高劑量組肝臟SOD活力顯著高于正常對照組（P<0.05）；模型對照組肝組織SOD活力顯著高于正常對照組（P<0.05）。核苷酸中劑量組肝臟GSH-Px活力顯著高于正常對照組和模型對照組（P<0.05）；核苷酸低劑量組和核苷酸高劑量組GSH-Px活力高于正常對照組（P>0.05），但差異無顯著性；模型對照組肝組織GSH-Px活力與正常對照組相當。核苷酸低劑量組、核苷酸中劑量組和核苷酸高劑量組肝臟MDA含量均顯著低于正常對照組和模型對照組（P<0.05）。

2.4膳食核苷酸對小鼠肝臟纖維化相關因子的影響

由圖2、圖3可知，核苷酸低劑量組a-SMA低于正常對照組（P>0.05），表明核苷酸低劑量組SAMP8小鼠肝星狀細胞活化程度較正常對照組低。核苷酸低劑量組、核苷酸中劑量組和核苷酸高劑量組肝臟MMP-2蛋白表達高于正常對照組，但差異無顯著性（P>0.05）。

2.5膳食核苷酸對小鼠肝臟轉錄組測序差異基因KEGG富集通路的影響由圖4可知，與正常對照組相比，核苷酸干預得到padj顯著的KEGG通路有3條，包括細胞周期（cell cycle）、氨基酸的生物合成（biosynthesis of amino acids）、糖酵解/糖異生（glycolysis/gluconeogenesis）（padj<0.05）。

3討論

肝纖維化是肝臟出現炎癥浸潤、受損等情況時，肝臟進行修復，細胞外基質合成降解與沉積不平衡導致。纖維化是慢性疾病的主要發病機制，同時也是導致衰老器官恢復組織功能失敗的主要原因。組織病理學結果顯示，相比于正常對照組，核苷酸干預組肝索結構正常、肝細胞飽滿、肝細胞核大而圓，這表明改善了核苷酸改善了肝組織與衰老相關的變化。羥脯氨酸含量是直接反映纖維化程度的指標，實驗結果顯示，核苷酸干預顯著降低肝臟羥脯氨酸含量，這說明核苷酸干預可以顯著改善SAMP8小鼠肝組織纖維化程度。

機體正常代謝會不斷產生自由基，當機體處于穩態下，人體可以通過內源性抗氧化劑包括酶與非酶途徑及時清除自由基。隨著衰老的進程發展，機體內針對自由基堆積的清除會逐漸減弱，導致自由基在體內堆積，對機體內大分子造成氧化損傷堆積，主要表現為脂質過氧化物丙二醛MDA、蛋白質過氧化產物羰基化蛋白等的水平增加[14]。核苷酸干預組顯著提高了肝組織SOD和GSH-Px活力，降低了肝臟MDA水平，說明核苷酸顯著提高了肝臟抗氧化能力。氧化應激與纖維化密切相關[15-16]。大量研究表明，長時間的炎癥和氧化應激可能通過導致肝臟病理性的修復從而促進肝纖維化的發展[17]；同時，氧化應激還可能通過影響肝臟細胞功能進而促進肝纖維化的進展[18]。核苷酸顯著提高了肝臟的抗氧化能力，清除肝臟過量的自由基，減少了肝臟病理性修復的出現，同時進一步保護了肝臟細胞功能，這可能是核苷酸發揮抗纖維化的機制。

α-SMA是肝星狀細胞激活的標志物，α-SMA含量增加意味著肝星狀細胞活化程度增加[19-20]，肝星狀細胞活化與肝臟纖維化密切相關。核苷酸低劑量組肝臟α-SMA蛋白表達低于正常對照組，表明核苷酸低劑量干預可以在一定程度上降低肝星狀細胞的活化。核苷酸低劑量干預可能通過降低肝星狀細胞活化起到抗纖維化作用。基質金屬蛋白酶是負責細胞外基質降解的酶，其中MMP-2是負責降解ECM重要酶之一[21]，本研究發現，核苷酸各干預組肝臟MMP-2蛋白的表達均高于正常對照組，這說明，核苷酸可能通過提高MMP-2的表達從而降解細胞外基質，達到抗纖維化的效果。

轉錄組是針對特定生理條件下所有可檢測到的轉錄產物的集合。RNA-Seq高通量測序通過查找各組樣本中差異基因，對差異基因進行富集可以找到干預條件下對樣本造成的影響。KEGG富集通路顯示，核苷酸干預組細胞周期、氨基酸的生物合成和糖酵解/糖異生等通路與正常對照組顯著不同。細胞周期有序進行，促進遺傳物質復制、細胞增殖，纖維化進展中，肝細胞在上游調控機制作用下，產生增殖、更新功能異常。核苷酸顯著影響肝臟組織細胞周期，提示核苷酸可能通過調節肝細胞周期衰老相關因子，產生延緩肝纖維化作用。核苷酸干預影響肝組織氨基酸的生物合成，這與CAI[13]核苷酸干預酒精性肝損傷的研究結果一致。肝臟作為機體重要的代謝器官，影響其糖酵解/糖異生功能可能改善了其整體功能，糖酵解/糖異生通路的影響可能也是核苷酸改善肝臟纖維化的機制。KEGG富集通路的發現，也更需進一步驗證。

4結論

綜上，膳食核苷酸不僅改善SAMP8小鼠肝臟與衰老相關的組織病理學表現，還顯著改善小鼠肝臟纖維化程度，其作用機制可能與提高肝臟抗氧化能力、調控纖維化相關因子、影響細胞周期和肝臟生理功能有關。參考文獻

[1]Stahl EC，Haschak MJ，Popovic B，et al. Macrophages in the aging liver and age-related liver disease[J].Front Immunol，2018（9）：2795.

[2]David GLEC，Cogger VC，McCuskey RS，et al. Age-related changes in the liver sinusoidal endothelium：a mechanism for dyslipidemia[J].Ann N Y Acad Sci，2007（1114）：79-87.

[3]McLean AJ，Cogger VC，Chong GC，et al. Age-related pseudocapillarization of the human liver[J].J Pathol，2003，200（1）：112-117.

[4]Sakai Y，Zhong R，Garcia B，et al. Assessment of the longevity of the liver using a rat transplant model[J].Hepatology，1997，25（2）：421-425.

[5]Cardoso AL，Fernandes A，Aguilar-Pimentel JA，et al. Towards frailty biomarkers：Candidates from genes and pathways regulated in aging and age-related diseases[J].Ageing Res Rev，2018（47）：214-277.

[6]Loffredo FS，Nikolova AP，Pancoast JR，et al. Heart failure with preserved ejection fraction：molecular pathways of the aging myocardium[J].Circ Res，2014，115（1）：97-107.

[7]Delire B，Lebrun V，Selvais C，et al. Aging enhances liver fibrotic response in mice through hampering extracellular matrix remodeling[J].Aging （Albany NY），2016，9（1）：98-113.

[8]Pais R，Charlotte F，Fedchuk L，et al. A systematic review of follow-up biopsies reveals disease progression in patients with non-alcoholic fatty liver[J].J Hepatol，2013，59（3）：550-556.

[9]Pinzani M，Rombouts K. Liver fibrosis：from the bench to clinical targets[J].Dig Liver Dis，2004，36（4）：231-242.

[10]World Health Organizoition.Global Health Estimates 2016：Deaths by Cause，Age，Sex，by Country and by Region，2000-2016［R］.Geneva：World Health Organization，2018.

[11]李勇，徐美虹.核苷酸營養學[M].北京：北京大學醫學出版社，2016.

[12]XU M，LIANG R，GUO Q，et al. Dietary nucleotides extend the life span in Sprague-Dawley rats[J].J Nutr Health Aging，2013，17（3）：223-229.

[13]CAI X，BAO L，WANG N，et al. Dietary nucleotides supplementation and liver injury in alcohol-treated rats：a metabolomics investigation[J].Molecules，2016，21（4）：435.

[14]Liguori I，Russo G，Curcio F，et al. Oxidative stress，aging，and diseases[J].Clin Interv Aging，2018（13）：757-772.

[15]Freund A，Orjalo AV，Desprez PY，et al. Inflammatory networks during cellular senescence：causes and consequences[J].Trends Mol Med，2010，16（5）：238-246.

[16]Parola M，Robino G. Oxidative stress-related molecules and liver fibrosis[J].J Hepatol，2001，35（2）：297-306.

[17]Friedman SL. Evolving challenges in hepatic fibrosis[J].Nat Rev Gastroenterol Hepatol，2010，7（8）：425-436.

[18]Luangmonkong T，Suriguga S，Mutsaers HAM，et al. Targeting oxidative stress for the treatment of liver fibrosis[J].Rev Physiol Biochem Pharmacol，2018，175：71-102.

[19]Schmitt-Grff A，Chakroun G，Gabbiani G. Modulation of perisinusoidal cell cytoskeletal features during experimental hepatic fibrosis[J].Virchows Arch A Pathol Anat Histopathol，1993，422（2）：99-107.

[20]Hernandez-Gea V，Friedman SL. Pathogenesis of liver fibrosis[J].Annu Rev Pathol，2011，6（1）：425-456.

[21]Vandooren J，Geurts N，Martens E，et al. Zymography methods for visualizing hydrolytic enzymes[J].Nat Methods，2013，10（3）：211-220.

Ameliorative Effect of Dietary Nucleotides on Liver Fibrosis in SAMP8 MiceWEI Chan，WANG Xiu-juan，LIU Rui，XU Mei-Hong ，ZHU Na，FAN Rui，LI Yong

（Department of Nutrition and Food Hygiene，School of Public Health，Peking University，Beijing 100191，China）Abstract：ObjectiveTo investigate the ameliorative effect of dietary nucleotides on liver fibrosis in SAMP8 mice.MethodA total of 48 male specific pathogen free SAMP8 mice were randomly assigned into 4 groups，including control group，nucleotides low dose intervention group，nucleotides medium dose intervention group and nucleotides high dose intervention group.Totaly 12 3-month-old male SAMR1 mice were used as model control group. Control group and SAMR1 group were fed with basal diet，while low，medium and high nucleotides groups were fed with basal diet supplemented with 0.3 g/kg，0.6 g/kg and 1.2 g/kg nucleotides. All groups were treated from 3 months to 12 months of age. At the age of 12 months，the histopathological structure of liver was observed by HE staining，and the liver hydroxyproline，fibrosis related factors and oxidative stress indexes were detected. Meanwhile，the control group and the low dose nucleotides group were selected for transcriptome sequencing，and the differential genes were enriched by KEGG.? ResultCompared with the model control group，the histological organization of the liver tissue in the control group exhibited increases of nuclear pyknosis，untidily organization of the hepatic cord，comprehensive hepatocellular ballooning，and several inflammatory cell infiltrations. Compared with control group，dietary nucleotides significantly ameliorated the fibrosis of liver related aging，increased the activities of SOD and GSH-Px in liver，and decreased the level of lipid peroxidase MDA in liver. Nucleotides also significantly affect cell cycle，biosynthesis of amino acids，and glycolysis/gluconeogenesis pathways. ConclusionNucleotides can ameliorate liver fibrosis in SAMP8 mice

Keywords： liver fibrosis；nucleotides；Senescence-accelerated mouse-prone 8（SAMP8）；senescence