基于UPLC-Q-TOF-MS技術分析西藏凹乳芹的化學成分及定量分析研究

歐珠　白瑪玉珍　楊斌　土旦吉熱　盧偉龍　李淑萍

摘要：目的：采用超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜（UPLC-Q-TOF-MS）技術，對凹乳芹中的主要酚類成分進行分析鑒定，并建立高效液相色譜（HPLC）定量分析方法。 方法：采用Waters BEH C18，以0.1%甲酸水（A） -乙睛（ B）為流動相進行色譜分離，流速0.3 mL/min，檢測波長為320 nm，負離子模式下掃描采集數據，快速識別和鑒定凹乳芹中的化學成分。根據鑒定的結果建立HPLC定量分析方法以用于凹乳芹的質量評價。結果：從凹乳芹中鑒定出19個化學成分，并建立了新綠原酸、綠原酸、阿魏酸和異綠原酸A的定量分析方法。結論：該方法為凹乳芹的化學成分質譜裂解規(guī)律和質量評價提供了科學依據。

關鍵詞：西藏凹乳芹；超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜；多酚；定量分析西藏凹乳芹（Vicatia thibetica）為傘形科凹乳芹屬植物凹乳芹的根，主要分布于拉薩、昌都、日喀則、山南和察隅等地，在四川和云南的西北部等地區(qū)也有分布[1]。西藏凹乳芹性溫，味辛、甘、微苦[2]，為藏藥五大根藥之一，其根被用做燉湯調料，葉片則被做藏芹菜制成美味佳肴。研究表明，西藏凹乳芹根含有阿魏酸、川陳皮素、異甘草素和多糖等活性成分[3-4]，用于治療月經不調、痛經、消化不良和貧血等[5]。本研究采用UPLC-Q-TOF-MS技術，對西藏凹乳芹的成分進行分析，并建立主要化學成分的高效液相色譜定量分析方法，為西藏凹乳芹的開發(fā)利用提供科學依據。

1儀器與試劑

Waters Xevo G2-XS QTOF，美國Waters公司；超高液相色譜1290，美國安捷倫公司；FY-250中藥粉碎機，永康市久品工貿有限公司；Gentrifuge 5180R高速冷凍離心機，德國eppendorf公司；FW-100型高速萬能粉碎機，北京科偉永興儀器有限公司；KH2200DE型數控超聲波清洗器，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；FA2104電子天平，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；UPT-11-2T優(yōu)普系列超純水儀，四川優(yōu)普超純科技有限公司。

凹乳芹（采收時間2021年）；新綠原酸、綠原酸、阿魏酸、異綠原酸A（上海源葉生物科技有限公司，純度≥98%）；甲醇（分析純），成都市科龍化工試劑廠；乙腈、甲醇（色譜純），美國MREDA公司。

2方法

2.1供試品溶液的制備

凹乳芹烘干打粉，過60目，稱取0.4 g，加入3 mL 80%甲醇40 ℃超聲40 min，6 000 r/min離心10 min，收集上清液，殘渣重復提取2次，合并定容至10 mL，0.22 μm濾膜過濾備用。新綠原酸、綠原酸、阿魏酸、異綠原酸A對照品20 mg用甲醇溶解定容至10 mL，以二倍稀釋法制備不同濃度的對照品溶液，冷藏備用。

2.2UPLC-Q-TOF-MS分析條件

色譜條件：Waters BEH C₁₈（2.1×100 mm，1.7 μm）色譜柱，檢測波長：320 nm；柱溫：35 ℃；流速：0.3 mL/min；進樣量：1 μL；流動相：0.1%甲酸-水溶液（A）、乙腈（B）；洗脫條件：0～2 min，B：5%～10%；2～10 min，B：10%～20%；10～15 min，B：20%～40%；15～17 min，B：40%～70%；17～20 min，B：70%～95%。

質譜條件：負離子模式采集數據，電壓是2.5 kv，脫溶劑氣流速600 L/h，錐孔氣流速50 L/h，離子源溫度250 ℃，離子源脫溶劑氣溫度120 ℃，樣品錐孔電壓40 V，離子源缺省電壓80 V，分子量范圍：m/z 50～1 500。

2.3超高液相色譜定量分析條件

色譜條件：采用梯度洗脫， Poroshell 120 PFP 2.7 μm C₁₈柱（4.6 mm×100 mm，2.7 μm）；檢測波長：320 nm；柱溫：35 ℃；流速：0.8 mL/min；進樣量：5 μL；流動相：0.1%甲酸-水溶液（A）、乙腈（B）；洗脫條件：0～10 min，B：5%～10%；10～20 min，B：10%～20%；20～27.5 min，B：20%～30%；27.5～32 min，B：30%～90%；32～40 min，B：90%（圖1、圖2）。

經HPLC分析后，根據供試品各化合物峰面積及標準曲線（表1）按式（1）計算含量。

W=C·D·V／m（1）

式（1）中，W—含量（μg/g）、C—樣品濃度（μg/mL）、D—稀釋倍數、V—樣品體積（mL）、m—樣品質量（g）。

3結果與分析

3.1酚酸類化合物的UPLC-Q-TOF-MS分析

通過化合物的一級、二級質譜及裂解規(guī)律并結合對照品比對、相關文獻檢索進行綜合分析，實現目標化合物的鑒定和確證。凹乳芹甲醇提取物負模式的質譜基峰離子流圖見圖3，通過UPLC-Q-TOF-MS，從凹乳芹的質譜總離子流圖中鑒定出19個酚酸類化合物，分別是咖啡酰奎尼酸、咖啡酰葡萄糖、阿魏酰奎尼酸、二咖啡酰奎尼酸和阿魏酸二聚體等，其中，4個化合物通過與對照品進行明確識別。鑒定的各化學成分的保留時間、質譜信息見表2。在負離子模式下，共鑒定出19個酚酸和酚酸糖苷類化合物，化合物1（保留時間0.860 min）和2（保留時間1.041 min）的準分子離子峰為m/z 191.0179 [M-H]^—，根據相關文獻[6]，結合二級質譜裂解規(guī)律推測為奎尼酸和檸檬酸。化合物9（保留時間4.883 min）的準分子離子峰為m/z 179.033 3 [M-H]^—，二級質譜產生的碎片m/z 135[M-H-CO₂]^—是脫去CO₂所得，確定為咖啡酸。化合物3、6、8的保留時間分別是3.119、4.213、4.612 min，為同分異構體，準分子離子峰為m/z 353[M-H]^—，共同碎片離子由失去咖啡酰基得m/z 191[奎尼酸-H]^—，為咖啡酰奎尼酸類化合物，通過與對照品比對，化合物3和6分別確定為5-咖啡酰奎尼酸（新綠原酸）和3-咖啡酰奎尼酸（綠原酸），結合文獻數據[7]，推測化合物8為4-咖啡酰奎尼酸（隱綠原酸）。化合物4、5、14的保留時間分別是3.123、4.102、8.701 min，準分子離子峰為m/z 341[M-H]^—，也為同分異構體，二級質譜的碎片離子m/z 179[咖啡酸-H]^—和m/z 135[咖啡酸-H-CO₂]—為失去1分子葡萄糖和CO2所得，推測為咖啡酰葡萄糖苷類化合物。化合物16（保留時間10.727 min）的準分子離子峰為m/ z 515.123 4 [M-H]^—，碎片離子m/z 353[咖啡酰奎尼酸-H]^—、m/z 179.033 3 [咖啡酸-H]^—和m/z 191[奎尼酸-H]^—提示該化合物為二咖啡酰奎尼酸，通過與對照品比對，化合物16確定為3，5二咖啡酰奎尼酸（異綠原酸A）。根據分子式和二級質譜裂解規(guī)律可以推斷化合物15和17也是二咖啡酰奎尼酸，參考相關文獻和色譜保留時間[8]，化合物15和17推測為3，4二咖啡酰奎尼酸（異綠原酸B）和4，5-二咖啡酰奎尼酸（異綠原酸C）。

化合物12（保留時間8.040 min）的準分子離子峰為m/z 193.049 8 [M-H]^—，失去甲基和CO₂得到碎片離子m/z 178[M-H-CH₃]^—和m/z 134[M-H-CH₃-CO₂]^—，通過與對照品比對，化合物12確定為阿魏酸。化合物7的保留時間為4.604 min，準分子離子峰為m/z 367.106 8[M-H]^—，二級質譜中基準峰為m/z 193[阿魏酸-H]^—，阿魏酸失去1分子水和CO2得碎片離子m/z 134 [阿魏酸-H -H₂O-CO₂]^—，與文獻報道一致[9]，被鑒定為3-阿魏酰奎尼酸。化合物10和11的保留時間分別是4.604 min和6.590 min，與化合物7為同分異構體，鑒于4-阿魏酰奎尼酸和5-阿魏酰奎尼酸二級質譜中基準峰分別為m/z 173和m/z 191[10]，化合物10和11被鑒定為為4-阿魏酰奎尼酸和5-阿魏酰奎尼酸。

化合物13（保留時間8.073 min）和18（保留時間15.276 min）的準分子離子峰分別為m/z 547.141 6 [M-H]^—和547.117 6[M-H]^—，分子式為C₂₆H₂₇O₁₃，失去1分子葡萄糖得碎片離子m/z 385[M-H-C₆H₁₀O₅]^—，碎片離子m/z 193[阿魏酸-H]^—、m/z 178[阿魏酸-H-CH₃]^—和m/z 134[阿魏酸-H-CH₃-CO₂]^—提示該化合物含有阿魏酰基團，根據相關文獻[11]，推測化合物13和18為阿魏酸二聚體-O-葡萄糖苷。化合物19（保留時間15.277 min）的準分子離子峰為m/z 577.130 0 [M-H]^—，二級質譜產生碎片離子m/z 385[M-H-C₁₀H₈O₄]^—、m/z 193[阿魏酸-H]^—、m/z 178[阿魏酸-H-CH₃]^—和m/z 134[阿魏酸-H-CH₃-CO₂]_—，結合參考文獻[12]，推測化合物19為阿魏酸三聚體。

3.2超高液相色譜定量分析與討論

新綠原酸、綠原酸、阿魏酸和異綠原酸A是凹乳芹的主要成分，其中綠原酸類化合物是凹乳芹重要的生理活性成分。綠原酸是植物細胞通過莽草酸途徑合成的一種苯丙素類物質，這類化合物廣泛存在于金銀花、杜仲等植物[13-14]，具有抗氧化、抗病毒、抗腫瘤和降血脂等多方面的藥理作用[15-17]。由表3可知，4種活性成分中綠原酸的含量遠高于其他3種活性成分含量，這一點在所有能夠檢測到的樣品中均能夠得到體現。新綠原酸和異綠原酸A的含量次之，而阿魏酸含量最低。16個樣品中有10個樣品檢測到新綠原酸，13個樣品檢測到綠原酸，12個樣品檢測到阿魏酸，7個樣品檢測到異綠原酸A，其中新綠原酸含量在105.97～201.06 μg/g之間，平均含量為148.56 μg/g，綠原酸含量在290.01～1 250.52 μg/g之間，平均含量為483.88 μg/g，阿魏酸含量在27.51～111.10 μg/g之間，平均含量為45.32 μg/g，異綠原酸A含量在82.51～208.73 μg/g之間，平均含量為130.20 μg/g。結合16個樣品來看，來自于丁青的樣品新綠原酸、綠原酸、阿魏酸、異綠原酸A含量均為最高，品質最優(yōu)，在014和015樣品中均未檢測到4種活性成分，品質相對較差。此外，由006和007 2組樣品的含量可以看出，來自于內地和藏區(qū)的不同品種生長在同一地區(qū)其功能成分含量也不盡相同。來自于內地的品種僅檢測到阿魏酸，且其含量明顯低于藏區(qū)品種，而來自于藏區(qū)品種僅有異綠原酸A未檢出，其他3種功能成分含量均在較高的水平上。

4結論與討論

本研究采用UPLC-Q-TOF-MS技術，對凹乳芹中的主要酚類成分進行了快速識別和鑒定，從凹乳芹中共鑒定出19個化學成分，其中咖啡酰奎尼酸、咖啡酰葡萄糖、阿魏酰奎尼酸、二咖啡酰奎尼酸、阿魏酸二聚體和三聚體是首次在凹乳芹中被發(fā)現，并建立了新綠原酸、綠原酸、阿魏酸和異綠原酸A的HPLC定量分析方法。綠原酸類化合物是凹乳芹的主要活性成分，表明凹乳芹具有抗氧化、抗病毒、抗腫瘤和降血脂等藥理作用。本研究為凹乳芹的化學成分質譜裂解規(guī)律和質量評價提供了科學依據。參考文獻

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Analysis of Chemical Constituents and Quantitative Analysis

of Vicatia thibeticu by UPLC-Q-TOF-MSOU Zhu，Baimayuzhen，YANG Bin，Tudanjire，LU? Wei-long， LI Shu-ping

（Institute of Vegetables，Tibet Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences，Lhasa 850032，China）Abstract：ObjectiveTo analyze and identify the main phenolic components in Vicatia thibetica by ultra performance liquid chromatography-quadrupole time of flight mass spectrometry （UPLC-Q-TOF-MS），and to establish a quantitative analysis method by HPLC.MethodWaters BEH C18（2.1×100 mm，1.7 μm） was used for chromatographic separation with 0.1%formic acid water （A）-ethyl acid （B） as mobile phase. The flow rate was 0.3 mL/min，and the detection wavelength was 320 nm. Data was scanned and collected in negative ion mode.Rapid identification and identification of chemical constituents in concave cress. HPLC quantitative analysis method was established according to the identification results to evaluate the quality of concave cress.ResultTotally 19 chemical composition were discovered in the Vicatia thibetica and a quantitative analysis method was set up for neochlorogenic acid，chlorogenic acid，ferulic acid and isochlorogenic acid A.ConclusionThis method provides scientific basis for the cracking law and quality evaluation of the chemical constituents of cress.

Keywords：Vicatia thibetica;UPLC-Q-TOF-MS;polyphenol;quantitative analysis