紫陀螺菌液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選

譚愛華 劉 璐 肖 倩 李方橋

（1湖北三峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖北 宜昌 443000；2三峽大學(xué)生物與制藥學(xué)院天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗室，湖北 宜昌 430002）

紫陀螺菌Gomphus purpuraceus，屬擔(dān)子菌亞門Basidiomycotina、非褶菌目Aphyllophorales、陀螺菌科Gomphaceae、陀螺菌屬Gomphus，是生長在闊葉混交林地的一種外生菌根菌，常在夏秋季形成子實(shí)體[1]。1999年7月，筆者首次在三峽地區(qū)西陵峽河谷區(qū)發(fā)現(xiàn)紫陀螺菌[2]，后研究發(fā)現(xiàn)紫陀螺菌在甘肅、云南、貴州、四川等部分地區(qū)也有生長[2]。紫陀螺菌鮮菇肉質(zhì)脆嫩，味道鮮美，營養(yǎng)豐富，干制后香味獨(dú)特，是一種極具營養(yǎng)價值的珍稀食用菌[3]。紫陀螺菌含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、糖類以及微量元素等[3-8]，具有較高的研究價值和開發(fā)潛力。紫陀螺菌目前尚未實(shí)現(xiàn)人工栽培，只能采集野生資源，而紫陀螺菌需要與松科或殼斗科等木本植物共生，且需共生宿主植物長大到一定年限后才能穩(wěn)定出菇，產(chǎn)量也極易受降雨量等環(huán)境因素的影響[1-9]。為有效開發(fā)利用紫陀螺菌，采用液體深層發(fā)酵的方式在較短時間內(nèi)獲得較多的菌絲體是一種更加便捷的方法。因此，筆者在紫陀螺菌生態(tài)研究[9]、菌種分離[10-12]的基礎(chǔ)上，進(jìn)行大量的培養(yǎng)基篩選試驗[2，13-14]。為篩選獲得最佳液體深層發(fā)酵配方，筆者主要采用均勻設(shè)計法，以紫陀螺菌的菌絲體生物量為指標(biāo)，并用高效液相色譜分析最佳配方和初始配方的發(fā)酵液產(chǎn)物豐富度，進(jìn)一步證實(shí)最佳配方的有效性，為紫陀螺菌進(jìn)一步研究提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株及培養(yǎng)基

供試菌株為Gp01，由采自西陵峽河谷區(qū)的野生子實(shí)體分離純化所得，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（武漢），保藏號為CCTCCM2021376。

斜面及平板培養(yǎng)基配方：去皮馬鈴薯250 g，瓊脂16 g，葡萄糖20 g，蛋白胨9 g，磷酸二氫鉀0.5 g，水1 000 mL。種用液體培養(yǎng)基配方：去皮馬鈴薯250 g，葡萄糖20 g，蛋白胨9 g，磷酸二氫鉀0.5 g，水1 000 mL。

1.2 試驗方法

1.2.1 液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基配方篩選試驗設(shè)計

將斜面菌種接種至平板培養(yǎng)基上，于23 ℃恒溫培養(yǎng)至菌落直徑為3～4 cm 時備用。配制液體培養(yǎng)基，分裝于500 mL 三角瓶，并于121 ℃、0.11 MPa 壓力下滅菌30 min 后冷卻備用。將經(jīng)活化的平板菌落外緣菌絲切碎后直接接入三角瓶中，置于磁力攪拌器上，轉(zhuǎn)速為900 r/min、溫度為23 ℃，恒溫振蕩培養(yǎng)直至菌液濃稠，在菌種轉(zhuǎn)接前24 h 再利用1 500 r/min的轉(zhuǎn)速將菌液攪碎呈均勻的菌漿備用。

選取馬鈴薯X1、葡萄糖X2、蛋白胨X3、磷酸二氫鉀X4、磷酸氫二鉀X5、硫酸鎂X6作為均勻設(shè)計的參試因素，每因素設(shè)7 個水平（表1），以菌絲體生物量為目標(biāo)函數(shù)（Y），采用均勻設(shè)計法U7（76）篩選深層發(fā)酵培養(yǎng)基配方[15-16]。

表1 試驗因素和水平表單位：g/L

將去皮的馬鈴薯切塊、煮沸20 min 后用六層紗布過濾，取其濾液，按試驗設(shè)計配制培養(yǎng)基。使用250 mL 三角瓶各自分裝100 mL，每個處理3 個重復(fù)，于121 ℃、0.11 MPa 壓力下滅菌30 min 后冷卻備用。吸取液體菌種（菌漿）8 mL 分別接入搖瓶中。將搖瓶置于23 ℃、150 r/min 的恒溫振蕩器中連續(xù)振蕩培養(yǎng)15 d。

深層發(fā)酵后的發(fā)酵液過濾（孔徑為0.178 μm），濾出的菌絲體用純水沖洗2～3 遍后，取出置于培養(yǎng)皿中，于40 ℃的烘箱內(nèi)烘干至恒重，精確稱量后計算干重，再換算成每1 000 mL發(fā)酵液中的菌絲體干重。

1.2.2 高效液相色譜（HPLC）法驗證優(yōu)化

將篩選出的最佳液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基和初始種用液體培養(yǎng)基進(jìn)行驗證，每個培養(yǎng)基3次重復(fù)，接種方法、接種量、培養(yǎng)方法同1.2.1。

用紗布分別過濾發(fā)酵液中的菌絲體后，每個培養(yǎng)基發(fā)酵液各取20 mL，經(jīng)乙酸乙酯萃取3 次，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮得到浸提物樣本。

每個浸提物樣本分別用0.5 mL 70%乙腈溶解，經(jīng)0.22 mm 濾膜過濾后上樣分析。HPLC 分析色譜柱為YMC-Pack ODS-A 系列C18 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），0.1%冰乙酸水溶液為流動相A，乙腈為流動相B，進(jìn)行梯度洗脫（0-40 min，B/A：10%→90%；40-55 min，B/A：90%→100%；55-75 min，B/A：100%→100%），流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長為254 nm，進(jìn)樣量10 μL。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用DPS V7.05對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳配方的篩選結(jié)果

2.1.1 結(jié)果統(tǒng)計及回歸方程的構(gòu)建與分析

培養(yǎng)后的發(fā)酵液較濃稠，其中菌絲體呈現(xiàn)絮狀、條狀、片狀、球狀等形態(tài)。各處理獲得的菌絲體生物量見表2。由表2 可知，水平7 即配方7 的菌絲體生物量最高。

表2 試驗設(shè)計及生物量單位：g/L

用DPS v7.05 對數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項式逐步回歸分析所得回歸方程為：

對回歸方程進(jìn)行檢驗，計算得出相關(guān)系數(shù)R2等于1.000 0，F(xiàn)值為99 999.850 0，剩余標(biāo)準(zhǔn)差SSE等于0.005 4。回歸方程的顯著性水平P值為0.002 4，P值小于0.01，達(dá)到0.01 的極顯著水平，結(jié)果表明該方程可信度較高。

2.1.2 回歸項的回歸系數(shù)t檢驗

由表3 可知，方程中X2（葡萄糖）的P值為0.000 1、X（3蛋白胨）的平方項P值為0.000 1、X（1馬鈴薯）與X（5磷酸氫二鉀）的P值為0.000 7、X（2葡萄糖）與X（3蛋白胨）的P值為0.002 4、X（3蛋白胨）與X5（磷酸氫二鉀）的P值為0.000 1，可看出上述各項P值均小于0.01，全部達(dá)到極顯著水平，說明方程中引入的各項因素對菌絲體生物量均有影響。

表3 各項回歸項的回歸系數(shù)檢驗結(jié)果

由表4 可知，各水平的觀測值與擬合值的數(shù)值差極小，另外，試驗組的最大擬合誤差絕對值也僅為0.0043，說明通過回歸方程擬合的菌絲體生物量數(shù)值與實(shí)際的試驗數(shù)值基本一致，也可進(jìn)一步證明上述構(gòu)建的回歸方程的準(zhǔn)確性。

表4 各水平的觀測值、擬合值和擬合誤差

2.1.3 配方優(yōu)化

通過DPS v7.05進(jìn)行回歸分析，并通過數(shù)學(xué)模型得到紫陀螺菌液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基的理論最優(yōu)組合，將其與組間最優(yōu)水平（配方7）進(jìn)行對比驗證（表5），獲得理論最優(yōu)配方，且菌絲體生物量為17.357 4 g/L。

表5 配方優(yōu)化驗證單位：g/L

2.2 發(fā)酵液成分分析

由圖1 可知，最優(yōu)培養(yǎng)發(fā)酵的色譜圖和初始種用液體培養(yǎng)基發(fā)酵的色譜圖完全不同，且前者比后者具有更多的出峰點(diǎn)。結(jié)果表明，最優(yōu)培養(yǎng)基的紫陀螺菌發(fā)酵液成分比初始種用液體培養(yǎng)基配方更豐富，從而得出構(gòu)建的理論最優(yōu)配方可使紫陀螺菌發(fā)酵得更充分。

圖1 紫陀螺菌發(fā)酵液的HPLC圖譜（波長為254 nm）

3 小結(jié)與討論

試驗構(gòu)建紫陀螺菌的最佳液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基配方：去皮馬鈴薯298 g，葡萄糖30 g，蛋白胨12 g，磷酸二氫鉀1.2 g，硫酸鎂0.2 g，水1 000 mL。再通過高效液相色譜法對比分析最佳配方和初始種用配方的發(fā)酵液成分，得出最佳配方紫陀螺菌發(fā)酵液能產(chǎn)生更多更豐富的發(fā)酵成分。這為紫陀螺菌在醫(yī)藥上應(yīng)用提供了一些理論支撐，今后可進(jìn)一步研究人工馴化紫陀螺菌的深層發(fā)酵及其產(chǎn)物。