外泌體在糖尿病視網膜病變的機制研究進展

王 勤,曾 鳳,盧亞梅,莊 菁,余克明,陳 熹,周元清,劉桂池

外泌體是廣泛存在于人體,由機體細胞產生并分泌的納米級細胞外囊泡,能相對穩定地存在于各種生物組織和體液中,并攜帶特定的miRNA、蛋白質、轉錄因子等多種信息分子,參與調控體內多種疾病的病理生理過程。近年來隨著外泌體在各學科研究的不斷深入,其在眼科學領域的研究也迅速開展,目前發現外泌體在糖尿病視網膜病變、年齡相關性黃斑變性、自身免疫性葡萄膜炎、角膜病及青光眼等多種疾病中發揮重要作用。隨著生活水平的提高,全世界糖尿病視網膜病變致盲人數逐年增加,而糖尿病視網膜病變機制研究未明,近年許多研究發現外泌體在其中發揮著重要作用,本文對外泌體在糖尿病視網膜病變的發生、發展機制的最新研究進展進行綜述。

?KEYWORDS：exosome; diabetic retinopathy; eye disease

0 引言

糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy, DR)主要由于長期高血糖狀態導致視網膜微循環障礙,通過促炎因子、趨化因子等多種炎癥介質,導致視網膜神經血管損傷、黃斑水腫等病理改變[1],而視網膜局部缺血缺氧,可發展成增殖性糖尿病視網膜病變(proliferative diabetic retinopathy, PDR),引發新生血管形成[2],最終發展為牽拉性視網膜脫離,造成不可逆的視力損害。目前,有關DR的病理機制尚不完全明確。近年來的研究表明DR可能與炎癥反應、細胞因子如細胞內黏附分子-1 (ICAM-1)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表達、氧化應激及PKC、AKT/ERK、MAPK等多種信號傳導途徑的激活有關,外泌體可能參與其中的一些重要環節[3]。近年來,外泌體在腫瘤、心血管及神經系統中取得了顯著研究成果,使外泌體的研究逐漸成為針對多種疾病的前沿熱點研究,以下就外泌體來源、生物學功能及近年來發現的不同來源的外泌體如何參于DR的生理或病理過程,以及外泌體作為潛在治療靶點,在DR保護方面的研究進展進行闡述。

1 外泌體來源和功能及提取方法

1.1外泌體的來源1987年Johnstone 等[4]在對綿羊網織紅細胞進行離心時獲得了具有活性的囊泡,并首次將其命名為外泌體。隨著對外泌體的不斷研究,發現外泌體是由細胞產生并分泌的細胞外囊泡(extracellular vesicles, EVs)。外泌體可有多種細胞來源,幾乎所有的細胞均可分泌,目前研究表明間充質干細胞、腫瘤細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、肥大細胞、內皮細胞等多種細胞均有外泌體分泌功能[5]。大多數外泌體直徑約30～150nm,可攜帶蛋白質、核酸、脂類及多種代謝產物。由于其獨特的脂質雙分子結構,使其能廣泛存在于血漿、唾液、房水、淋巴液、玻璃體液等各種體液中。

1.2外泌體的形成過程外泌體由細胞內吞、出芽作用而形成,首先形成腔內囊泡(intraluminal vesicles, ILVs),進一步加工修飾轉變為多泡體(multivesicular bodies, MVBs)。當MVBs通過多種機制最終與細胞膜相融時,ILVs從細胞內被釋放,形成外泌體[6]。MVBs可通過轉運所需的內體分選復合物(the endosomal sorting complex required for transport, ESCRT)依賴途徑和ESCRT非依賴途徑兩種不同的途徑形成,具體過程可分為起始、內吞、多泡體形成及分泌4個階段[7]。ESCRT途徑依靠ESCRT 0～Ⅲ、分選蛋白4(Vps4)和組成型熱休克蛋白Hsp-70等共同構成的復合物發揮作用[8],主要通過對泛素化蛋白的進行分選,維持ILVs內容物的特異性,但目前對ESCRT內分子間如何協同作用并將特定的內容物轉運至ILVs中的機制仍不明確[9]。ESCRT非依賴途徑在組裝形成MVBs時,主要由神經酰胺對其內容物進行篩選,促進特定的蛋白質、脂質及RNA進入ILVs,同時促進外泌體的釋放[10]。

1.3外泌體的生物學功能外泌體可攜帶多種蛋白質、脂質、核酸及代謝產物等多種生物信息分子,這使得外泌體具有多種功能。外泌體可通過釋放特定的蛋白質而激活體內的信號傳導通路,調節下游細胞的功能[11]。外泌體還可以攜帶活性信使RNA(mRNA)、miRNA,調節靶細胞的基因表達[12]。因此外泌體可參與機體的多種病理、生理過程,An等[13]研究表明外泌體參與機體的免疫反應和炎癥反應,具有促進新生血管形成,參與細胞增殖和分化調節等功能。目前已經發現外泌體在代謝、腫瘤、心血管及神經退行性病變等多種疾病方面具有其獨特的診斷和治療價值[14]。

1.4外泌體的提取方法外泌體存在于多種體液,如血液、房水、唾液及相關培養基的上清液中,恰當的提取方法能最大限度的保證外泌體提取的純度及質量。目前有效地分離提取外泌體的方法包括超速離心、密度梯度離心、聚合物沉淀、超濾、免疫親和捕獲、尺寸排阻色譜法等,其中傳統的超速離心法是目前分離外泌體的金標準[15],超速離心法具有簡單易操作、低成本、適合大批量提取的特點。但在一定的離心力下,傳統的超速離心并不能將外泌體微泡和其他蛋白質、脂質等分離[16],并可能對外泌體造成機械性損傷。密度梯度離心在一定程度上彌補了傳統超速離心純度低的缺點,但其產率相對較低。尺寸排阻法是根據不同囊泡的直徑大小不同,對其進行梯度洗脫,該方法最大特點是能保持外泌體的自然生物活性[17]。免疫親和捕獲法是依靠體內的特異性抗原抗體反應對外泌體表面的標志物進行捕獲分離的方法,該方法存在的主要問題是不能很好地保持外泌體的天然活性狀態[18]。因此,盡管有很多的方法能分離提取外泌體,但目前外泌體的制備仍然沒有標準化,根據不同的研究樣本及應用環境,需要采取不同的提取方法,以保證實驗數據的準確性。

2 外泌體與DR

2.1血循環源性外泌體參與DR多種病理過程血循環源性外泌體可作為DR的新型生物標志物,相較于眼內容物等生物標本,如玻璃體及房水等,血漿及血清等體液成分獲取更簡單、患者更容易接受、且獲取的標本量更大,使得外泌體的分離提取更簡便。Mazzeo等[19]通過微整列分析DR患者中miRNA的差異表達,并采用定量PCR法明確了miR-150-5p、miR-21-3p和miR-30b-5p的表達升高。進一步研究表明,miR-150-5p可調節 VEGF表達[20],miR-30b-5p可介導間隙連接蛋白GJA1下調促進新生血管形成和內皮細胞遷移[21]。因此攜帶miRNA的外泌體可以作為DR的潛在生物標志物。

與非糖尿病患者相比,糖尿病患者IFN-γ和TNF-α、白細胞介素-1β(IL-1β)水平升高,表明炎癥與DR相關[22]。Huang等[23]研究表明糖尿病血漿外泌體可激活經典的補體級聯反應,刺激機體趨化因子和促炎細胞因子上調,造成血管損傷。S100A8是單核細胞和中性粒細胞分泌的促炎蛋白,于榮國等[24]研究發現DR患者的外泌體和玻璃體中S100A8表達明顯增高,可作為潛在的抗炎治療靶點。同時,高糖狀態可激活單核細胞,通過外泌體中的ICAM-1,進一步激活內皮細胞,加重血管炎癥[25]。由此可見,外泌體通過參與運輸炎癥因子、激活內皮細胞等,在DR中發揮重要作用。

PDR是指在視網膜缺血的基礎上引發新生血管形成,新生血管反復出血可造成玻璃體積血及牽拉性視網膜脫離[26],導致視力不可逆喪失。新生血管形成與多種細胞因子表達及信號通路的激活有關,Tokarz等[27]對糖尿病患者細胞外囊泡中細胞因子及炎性因子水平進行分析,結果顯示血管內皮生長因子可溶性受體2(VEGFR-2)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、血管抑制素、組織抑制劑等分泌明顯增加,這表明外泌體可作為信息傳遞者參與視網膜新生血管的形成。外泌體對新生血管的影響主要取決于外泌體中的成分,Li等[28]通過高通量測序及PCR檢測發現PDR患者血清外泌體中circRNA、miRNA及mRNA表達均存在差異,進一步研究發現血清外泌體建立了一個circRNA-miRNA-mRNA ceRNA網,circRNA可通過miRNA反應元件與miRNAs競爭性結合,抑制miRNA對其靶向mRNA的負性調控,稱為競爭性內源性RNA(ceRNA),而mRNA可通過PI3K-Akt、MAPK、Wnt等信號通路對新生血管產生影響。 Liu等[29]在糖尿病小鼠周細胞中發現環狀RNA-cPWWP2A高表達,并通過增強miR-579及其靶基因(包括緊密連接蛋白、血管生成素1、沉默信息調節因子1)表達,上調視網膜血管內皮細胞的增殖、成管能力,cPWWP2A或miR-579表達的干預可能成為治療DR新的思路。而Moisseiev 等[30]研究發現缺氧條件下骨髓間充質干細胞來源的外泌體能有效抑制缺氧導致的視網膜新生血管形成,對視網膜其保護作用。

2.2視網膜色素上皮細胞源性外泌體與氧化應激視網膜色素上皮細胞是介于脈絡膜和視網膜間的單層上皮細胞,極易受到氧化應激,尤其是活性氧(ROS)的影響。ROS是指含氧的反應性活性化學物質,包括過氧化物和超氧化物等,當視網膜色素上皮細胞受到過量ROS刺激時,將會導致細胞發生特異性改變:包括視網膜局部炎癥、細胞自噬以及VEGF過度產生等,并釋放更多含有VEGFR2的外泌體[31],VEGFR2可進一步通過磷脂酶-Cγ-蛋白激酶-C途徑激活MAP激酶介導新生血管的遷移與形成[32]。張惟等[33]研究表明在氧化應激條件下,人視網膜色素上皮細胞(ARPE-19)外泌體可上調VEGF-A表達,同時下調絲氨酸/蘇氨酸激酶(Akt),VEGF-A是血管生成的主要調節劑,可與內皮細胞囊泡結合,增加血管通透性,促進新生血管形成;Akt作為RPE細胞的保護因子,可誘導下游效應子FKHR和GSK-3beta的磷酸化,其降低可導致細胞損傷。而抑制氧化應激對RPE可起保護作用,Maisto 等[34]實驗顯示黑色素受體5激動劑PG-901可減少視網膜色素上皮ROS的產生及VEGF的釋放,提高高糖條件下視網膜色素上皮的存活率,并可減少新生血管的形成,抑制DR進展。

2.3 Müller細胞來源的外泌體與DR Müller細胞作為特化的神經膠質細胞,在維持血視網膜屏障和神經元功能方面發揮重要的作用。Proia 等[35]研究發現神經膠質細胞可分泌含有成纖維細胞生長因子-2和血管內皮生長因子的細胞外囊泡。Liu 等[36]探索了人Müller細胞來源的外泌體 miR-9-3p 的功能,發現 miR-9-3p 可限制DR中的1-磷酸鞘氨醇(S1P1),而S1P1可抑制AKT/ERK信號通路對VEGF-A誘導的VEGFR2磷酸化的影響,S1P1的限制影響了VEGFR2的活性,促進新生血管形成。Inada等[37]研究表明在缺氧條件下,小膠質細胞被激活,釋放促炎細胞因子如IL-1β,促進Müller細胞產生VEGF,導致血-視網膜屏障(blood-retinal barrier, BRB)功能破壞。同時其他來源的外泌體亦可對Müller細胞產生影響,富含血小板血漿的外泌體可以刺激PI3K-Akt信號通路和Yes相關蛋白表達,改善視網膜纖連蛋白及結締組織生長因子的表達,促進Müller細胞增殖并增加其纖維化活性,進而對BRB的緊密性產生破壞作用,加重DR進展[38]。同時胰腺β細胞分泌的含miR-15a外泌體可以激活Akt3通路導致氧化應激,造成Müller細胞凋亡[39]。

2.4外泌體對DR的保護作用外泌體相比于細胞性質更加穩定更易于貯存,外泌體獨特的穩定性及脂質雙分子結構使通過外泌體給藥成為可能,近年來外泌體在各種疾病中的治療作用也得到深入研究。視網膜缺血是視力受損和喪失的主要原因,也是DR晚期的主要表現。Mathew等[40]通過模擬體外缺血條件和體內視網膜缺血研究表明,間充質干細胞來源的外泌體可被視網膜R28細胞以劑量及飽和度依賴的方式內吞,可通過降低神經炎癥反應及減少神經細胞的凋亡對視神經起保護作用。而人臍帶間充質干細胞來源的外泌體miR-17-3p通過靶向信號轉導和轉錄激活因子1(STAT1)改善DR小鼠的炎癥反應和氧化損傷,并抑制視網膜細胞的凋亡[41]。Li 等[42]進一步動物實驗證明骨髓間充質干細胞誘導的外泌體miR-486-3p可經由Toll樣受體4(TLR4)/NF-κB軸抑制氧化應激、炎癥和細胞凋亡,并促進Müller細胞增殖,對DR小鼠起保護作用。

3 總結

隨著外泌體的分離、純化及檢測技術不斷進步,使得大量各種細胞來源的外泌體被深入研究。外泌體在越來越多的疾病診斷及治療中有了突破性的進展,而其在眼部疾病,特別是DR中的研究也在不斷深入。血循環源性外泌體可作為DR的新型生物標志物在DR的早期診斷中起重要作用;同時,外泌體也可通過炎癥刺激、新生血管形成、氧化應激等機制加速DR的發展,外泌體亦可對DR的發生、發展起保護作用。盡管目前已經有大量的研究證實了DR的發生和發展中外泌體起至關重要的作用,但其潛在的機制目前仍不十分清楚,需要進一步的科學研究。