自噬在視網膜和眼部疾病中的研究進展

曾思雨,杜 磊,邢怡橋

自噬維持細胞內成分降解和再循環的穩態,是一種關鍵的細胞質量控制機制。在應激反應中,自噬促進細胞成分的降解,以提供細胞代謝所需的營養物質和能量。視網膜是眼睛中轉導和處理視覺信息的光敏組織,對物質和能量需求極高,基礎水平的自噬對維持視網膜細胞的穩態和視覺系統的正常功能至關重要。本文總結了自噬途徑參與青光眼、年齡相關性黃斑變性、糖尿病視網膜病變、視網膜營養不良和視網膜脫離等眼科疾病的最新研究,為未來通過調控自噬治療眼部疾病提供理論依據。

?KEYWORDS：autophagy; retina; retinal ganglion cells; photoreceptor

0 引言

自噬是一種介導細胞內成分降解和再循環的分解代謝途徑,將受損和衰老的細胞器和病原體等有害成分運送到溶酶體中清除[1]。根據待降解物質轉運到溶酶體的方式,自噬分為3種類型:(1)巨自噬:雙層膜囊泡結構包裹蛋白質和細胞器形成自噬體,自噬體隨后與溶酶體融合,在溶酶體水解酶的作用下進行消化和降解;(2)分子伴侶介導的自噬:一種僅存在于哺乳動物細胞中的選擇性降解物質途徑,通過Hsc70伴侶蛋白識別特異性表達KFERQ氨基酸序列的靶蛋白;(3)微自噬:待降解物質通過溶酶體或內體膜內陷進入溶酶體[2-4]。

自噬發生在所有類型的細胞和組織中,正常生理狀態下處于低水平狀態,有利于物質循環、能量交換和信息傳遞,對維持生物體的穩態起核心作用[5]。然而,自噬也可以被饑餓、缺氧和感染等應激原誘導,在這種情況下,自噬介導細胞成分的降解,以產生維持細胞代謝所需的能量和營養物質[6]。此外,自噬是細胞內主要的質量控制途徑之一,主要降解錯誤折疊或聚集的蛋白質和受損細胞器[7]。因此,自噬的缺陷和失調會破壞機體的平衡狀態,導致各種疾病的發生,例如癌癥、免疫性疾病和神經退行性疾病等[8-9]。

1 自噬過程的調控

目前研究最多的巨自噬是一個受到嚴密調控的多步驟過程,上游調節因子雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)和腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase, AMPK)以相反的方式調控自噬整個過程[6]。自噬相關基因(autophagy-related genes, ATGs)家族成員參與調節自噬的各個階段,轉錄因子EB(transcription factor EB, TFEB)是ATGs的主要轉錄調控因子[10-11]。在靜息狀態下,磷酸化TFEB定位于細胞質,而當饑餓、感染等應激發生時,TFEB去磷酸化并轉位到細胞核中,可直接與啟動子序列結合,增強ATGs和溶酶體相關基因的表達[12]。此外,叉頭轉錄因子(forkhead box O, FOXO)也是重要的自噬調節因子,在應激的誘導下FOXO與啟動子區結合,激活自噬基因的表達[8]。而He等[13]的研究表明FOXO的功能可能獨立于轉錄調控,通過與細胞質中的ATGs直接相互作用來調節自噬。最近一項研究表明,FOXO可以與TFEB形成復合物,作為組合轉錄因子共同調節靶基因的表達[14]。

自噬過程包括誘導、起始、自噬前體形成、自噬體形成、與溶酶體融合和降解。(1)Unc51樣激酶(unc51-like kinase, ULK)復合體在自噬的啟動中起核心控制作用,由ULK1、ATG13、ATG101和200kD的FLK家族相互作用蛋白(FLK family interacting protein of 200kD, FIP200)組成[15]。自噬啟動激酶ULK1在應激誘導下磷酸化激活,特異性地積累到內質網膜上,與液泡分選蛋白15(vacuolar protein sorting, VPS15)、ATG14L和Beclin-1相互作用,增強VPS34復合物的募集[16]。隨后,活性的VPS34復合物作為Ⅲ型磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase, PI3K)產生磷脂酰肌醇3-磷酸(phosphatidylinositol 3-phosphate, PI3P),促進ATGs的募集,從而啟動自噬前體形成[11]。(2)自噬體膜延伸是自噬體形成的關鍵步驟,涉及兩種由ATG7催化的泛素化反應,一種是形成自噬延伸復合物ATG5-12/16L1,另一種是微管相關蛋白輕鏈3-Ⅰ(microtubule-associated protein light chain3-Ⅰ, LC3-Ⅰ)與磷脂酰乙醇胺(phosphatidyl ethanolamine, PE)偶聯形成自噬標志物LC3-Ⅱ,允許自噬體膜延伸閉合至成熟。(3)自噬體最終與溶酶體融合形成自噬溶酶體,自噬溶酶體中的貨物被溶酶體酶降解得以循環利用[17-18]。最新研究表明,自噬實際上是一個具有高度選擇性的過程,自噬體靶向降解特定的細胞器和細胞質成分[19]。在選擇性自噬中,自噬受體的典型特征是含有LC3結合區域(LC3-interacting regions, LIRs),LIRs通過與LC3相互作用將泛素化的貨物連接到自噬體膜,進行溶酶體降解[19]。

2 視網膜自噬

視網膜具有非常高的物質和能量需求,用于維持神經傳遞、光傳導和正常細胞功能所需的神經元興奮性,高水平的基礎自噬對于視覺系統至關重要,自噬水平的降低會影響細胞代謝產物合成,減弱視網膜細胞對應激的調節能力[20-22]。自噬缺陷動物模型的建立有助于深入探索自噬在各種組織中的作用,研究發現ATG4B缺陷的小鼠視網膜顯示LC3脂化水平降低和p62表達增多,證實視網膜基礎自噬水平降低[23-24]。此外,缺乏ATG5的視網膜在胚胎發育過程中出現視網膜神經節細胞(retinal ganglion cells, RGCs)分化減少和軸突發育缺陷[25]。然而,最新研究發現,在病理情況下,過度激活的自噬可能會對神經元細胞產生毒性作用,誘導細胞凋亡,同時由于RGCs軸突部位線粒體降解增加,最終導致神經變性[26-27]。這些結果表明視網膜依賴基礎自噬維持正常的結構和生理功能,任何自噬缺陷或失調都會破壞細胞內穩態,參與各種視網膜和眼部疾病的發生[28]。

3 自噬與眼部疾病

3.1青光眼青光眼是一種以RGCs不可逆丟失為特征的神經退行性疾病,目前已成為世界上第二大致盲因素[29]。RGCs是中樞神經系統中將視網膜視覺信息傳遞到大腦的神經元,由于RGCs的不可替代性,通過有效的手段來逆轉RGCs損傷和視神經萎縮至關重要[30-31]。利用小鼠視神經橫斷模型,首次在體內證實自噬對RGCs的保護作用,Rodríguez-Muela等[24]發現雷帕霉素誘導自噬使RGCs數量增加了40%,而特異性敲除小鼠ATG5基因后,RGCs存活率下降33%。最近一項研究發現,在自噬缺陷的情況下,Ambra1+/gt小鼠RGCs對視神經鉗夾損傷的易感性隨著年齡的增長而增加,表明自噬激活具有神經保護作用[32]。

眼壓是青光眼發展的重要危險因素,由房水循環系統調節,而小梁網作為房水的主要流出途徑,負責維持正常的眼壓水平,既往研究證實青光眼中存在小梁網的自噬失調[33-34]。Nettesheim等[35]的研究發現,沉默ATG5和ATG7促進了轉化生長因子(transforming growth factor-β, TGF-β)誘導的小梁網纖維化,導致房水外流減少,眼壓升高。而Zhu等[36]證明雷帕霉素可通過激活自噬減輕糖皮質激素引起的眼壓升高、小梁網細胞超微結構改變和RGCs損傷。此外,在激光光凝誘導鞏膜外流道損傷模型中,Ⅲ型PI3K抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine, 3-MA)使自噬流受阻,加重了高眼壓引起的軸突變性,相反,雷帕霉素表現出明顯的視神經軸突保護作用[37]。因此,自噬調節可能成為改善青光眼RGCs變性的新治療靶點。

目前已經在多種不同的青光眼模型中證實氧化應激水平的增加,線粒體是細胞內活性氧(reactive oxygen species, ROS)的主要來源,高眼壓誘導線粒體裂變以及視網膜缺血均會刺激ROS的產生,過量的ROS對DNA、蛋白質和脂質造成損傷,而RGCs由于耗氧量大對氧化損傷尤其敏感[21,38]。研究發現,自噬缺陷動物的細胞ROS水平升高,可能是由于自噬受損導致氧化細胞產物的清除障礙,通過誘導自噬減少氧化應激損傷可能是青光眼治療的理想選擇[39]。

3.2年齡相關性黃斑變性年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration, ARMD)是一種累及黃斑的神經退行性視網膜病變,視網膜色素上皮(retinal pigmented epithelium, RPE)變性是ARMD的早期病理標志[40]。RPE細胞負責吞噬、降解和回收在視覺循環中脫落的光感受器外節(photoreceptor outer segments, POSs),維持光感受器的穩態,而既往研究證實RPE細胞中ATG5的缺陷會損害RPE細胞降解POSs的能力[5,41]。隨著時間的推移,未完全消化的POSs成分在RPE細胞溶酶體中逐漸積累,稱為脂褐素[42]。脂褐素是一種衰老的生物標志物,主要成分是N-亞視黃基-N-視黃基-乙醇胺(N-retinyl-N-retinylidene ethanolamine, A2E),抑制溶酶體水解酶活性的同時阻止其降解,對溶酶體功能造成障礙,所有ARMD相關事件中都可以觀察到自噬流和POSs降解的阻斷[20,43]。此外,研究發現衰老與自噬活性的下調密切相關,證實自噬受損參與ARMD的病程進展,自噬流障礙引起的蛋白質穩態失衡是神經退行性變的發病機制之一,提示刺激自噬可作為ARMD潛在的治療手段[16]。

目前,ARMD的大多數研究使用的是ARPE-19細胞系,ARPE-19細胞表達特征性的RPE標記物[44-46]。最近,Fernandez-Godino等[47]通過基因編輯使ARPE-19細胞突變產生異常的細胞外基質,激活RPE細胞補體系統,形成基底沉積物。研究發現,使用A2E培養RPE細胞在早期誘導自噬,雷帕霉素通過mTOR通路增強自噬,改善A2E引起的細胞死亡,減少炎性因子和血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)生成,發揮保護作用[48]。另外,Sun等[49]的實驗結果表明,谷胱甘肽耗竭誘導的氧化應激升高RPE細胞自噬流水平,并引起衰老相關基因的表達增加,而雷帕霉素通過刺激自噬顯著改善細胞早衰,抑制自噬則產生相反的結果。Chan等[50]也報道了使用3-MA抑制自噬后,碘酸鈉誘導的RPE細胞死亡和視網膜變性加重,表明自噬在ARMD早期階段保護RPE細胞抵抗氧化應激損傷,并為ARMD的靶向治療提供了新的思路。

3.3糖尿病視網膜病變糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy, DR)是糖尿病最常見的眼部微血管并發癥,長期的高血糖誘發視網膜早期炎癥、內質網應激、線粒體功能障礙和氧化損傷,周細胞丟失是DR早期標志之一[51-53]。自噬在DR中的作用具有雙重性,早期DR中的自噬反應一般由內質網應激介導,促進周細胞存活和受損蛋白的降解,然而當處于長時間的內質網應激時,自噬加重周細胞死亡[54]。此外,血管外氧化和糖基化修飾的脂蛋白進入視網膜后表現出顯著的細胞毒性,抑制細胞活性,加重內質網應激誘導的RPE損傷[55]。最近一項實驗發現暴露于高糖條件下的ARPE-19細胞自噬激活,使用3-MA抑制自噬后,細胞活性顯著下降,促進ROS積累和炎癥因子白細胞介素-1β(interleukin 1β, IL-1β)的分泌,并激活NOD樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3, NLRP3)炎癥小體,提示自噬在DR中的細胞保護作用,可能成為預防DR發展和進展的治療靶點[56]。

目前,越來越多的報道強調了視神經變性在DR早期階段的重要性[20,52]。Amato等[57]發現用高糖處理的小鼠視網膜外植體中,神經元細胞凋亡顯著增加,同時自噬通量顯著降低,奧曲肽通過抑制mTOR通路激活自噬,改善細胞凋亡,而用氯喹阻斷自噬后則消除了奧曲肽的抗凋亡作用,表明自噬和細胞凋亡之間的平衡對神經元存活十分重要。Park等[58]也報道在DR中AMPK通路上調誘導的自噬促進RGCs的存活,而抑制自噬RGCs凋亡顯著增加。上述研究證實激活AMPK和抑制mTOR誘導自噬通量可以顯著改善視網膜變性,在DR中發揮神經保護作用。

3.4視網膜營養不良視網膜營養不良是一組遺傳異質性視網膜疾病,主要由于光感受器功能障礙和死亡而導致不可逆的視力喪失[59]。視網膜色素變性是最常見的視網膜營養不良,其特征是早期階段視桿細胞的進行性變性。導致各種炎癥因子以及ROS的釋放,改變光感受器穩態,進而影響視錐細胞的存活[60]。

既往研究證實,適當的自噬是維持光感受器穩態所必需的,自噬缺陷引起視紫紅質和轉導蛋白在細胞內的異常積累,導致光感受器死亡[61-62]。rd10小鼠是一種廣泛使用的視網膜色素變性模型,由于磷酸二酯酶β亞基突變導致酶功能異常,環鳥甘酸水平升高,引發視桿細胞變性和繼發性視錐細胞死亡[63]。Yang等[64]發現敲除Sigma-1受體的rd10小鼠早期激活視網膜自噬,保護視桿細胞免受損傷,隨著視桿細胞死亡加劇,細胞內Ca2+大量積累誘導細胞凋亡,自噬流減少,引起壞死性凋亡和視錐細胞死亡。然而,過度激活的自噬在某些情況下可能會加劇光感受器變性,相反,適當阻斷自噬促進蛋白酶體的激活,加速錯誤折疊的視紫紅質降解,促進光感受器存活[65]。上述研究表明自噬對于視桿細胞和視錐細胞的存活十分重要,未來可能成為光感受器退行性病變的治療靶點。

3.5視網膜脫離視網膜脫離是指神經上皮層與RPE的分離,由于光感受器失去RPE的營養供給和代謝支持,引起光感受器缺氧、營養剝奪和細胞死亡[66]。視網膜脫離早期誘導光感受器細胞自噬的激活,阻斷自噬后光感受器細胞凋亡增加,隨著脫離的時間延長,自噬通量降低,光感受器細胞由存活轉變為死亡[67]。Xiao等[68]也發現ATG5基因敲除小鼠視網膜脫離后視桿細胞凋亡和程序性壞死增加,自噬促進光感受器內蛋白質的降解,抵抗其細胞毒性作用。此外,Ding等[69]的實驗證實雷帕霉素自噬在視網膜脫離過程對光感受器細胞具有明顯的保護作用,自噬的激活抑制ROS生成和凋亡誘導因子的釋放,減少光感受器細胞發生壞死性凋亡。因此,誘導自噬延長光感受器的存活時間是視網膜脫離的關鍵治療策略。

4 小結

本文總結了自噬在視網膜和眼部疾病中的重要作用,視網膜依賴基礎自噬維持正常的結構和生理功能,任何自噬缺陷或失調都會破壞細胞內穩態,因此,自噬-溶酶體途徑的改變與許多常見的眼部疾病高度相關,自噬在病理情況下主要用于維持RGCs和軸突的穩態,并促進POSs降解和視覺循環以保護光感受器和視網膜功能,然而,過度激活的自噬也可能會產生有害作用。促進自噬相關基因的轉錄和增強溶酶體活性有望用于治療眼部疾病和其他神經退行性疾病,在特定條件下,一些自噬誘導劑已被證實可以顯著抑制眼部疾病的進展,減輕視力喪失。然而,由于自噬在不同疾病類型和階段的作用機制可能不同,未來需要更多的研究了解自噬是如何特異性調節各種視網膜細胞。綜上所述,通過調控自噬治療眼部疾病已成為一種可行的思路,進一步的研究有助于我們了解以自噬和溶酶體途徑為靶點的治療策略在臨床應用中的潛力。