角膜神經調控眼表微環境的研究進展

常 鳴,林雄世,王雙勇

角膜是眼前段透明的外層結構,由高密度的神經組織支配。在角膜神經支配過程中,三叉神經節起源的角膜神經穿過上皮層和基質層中不同類型的角膜細胞。角膜基質細胞、上皮細胞、免疫細胞等多種細胞和角膜神經之間發生密切的相互作用,共同維持角膜微環境穩態。此外,角膜神經參與許多眼表疾病的發生發展過程。角膜神經釋放多種活性肽物質,參與調控角膜感覺、維持上皮完整性和增殖、促進傷口愈合及調控角膜局部炎癥和免疫反應等。本文對角膜神經在眼表微環境調控作用的研究進展進行綜述,為角膜神經相關疾病的研究及治療提供新的思路。

?KEYWORDS：corneal nerve; ocular surface microenvironment; corneal neovascularization; neurogenic inflammation; wound healing

0 引言

角膜是一種無血管卻富含神經纖維的透明組織,是體內神經纖維分布密度最高的組織之一[1]。角膜神經纖維源于三叉神經節的眼支,在角膜緣處脫髓鞘[2],并進入角膜基質層形成基質神經叢,隨后繼續向前移行,形成上皮下神經叢和/或基底神經叢[3]。解剖學上,角膜神經和角膜細胞(包括角膜緣干細胞、上皮細胞和角膜細胞)之間的緊密接觸決定了它們之間在生理和病理方面的密切關系[4]。角膜神經在調節角膜感覺、維持上皮完整性和增殖、傷口愈合以及角膜局部炎癥和免疫反應中發揮重要作用[5]。角膜神經釋放活性肽物質,如神經肽P物質(SP)、降鈣素基因相關肽(CGRP)、神經生長因子(NGF)、表皮生長因子(EGF)等,參與調控眼表局部微環境的穩態[6]。本文就角膜神經在調控眼表微環境的功能方面的研究進展進行綜述。

1 角膜神經與免疫赦免交感性丟失

角膜組織無血管及淋巴管分布,且表達免疫抑制因子及Fas配體,抑制免疫細胞激活,并誘導免疫細胞凋亡,從而使其在免疫學上處于相對“免疫赦免”狀態[7]。因此,相比較其他器官移植,首次原位角膜移植排斥反應發生率較低。然而,奇怪的是,首次原位角膜移植后,對側眼角膜移植排斥反應的發生率增加2倍,這種現象稱為“免疫赦免交感性丟失”(sympathetic loss of immune privilege,SLIP)[8]。Paunicka等[9]研究發現,角膜感覺神經來源的神經肽SP參與SLIP的發生。初次角膜移植眼的手術操作,導致對側眼感覺神經末梢SP的釋放,SP抑制α-MSH(一種遲發性變態反應抑制因子)表達及CD4+CD25+Treg的形成。此外,SP促進CD11c+樹突狀細胞(dendritic cell,DC)轉化為反向抑制細胞(contrasuppressor,CS),CS進而抑制CD8+Treg表達CD103和IFN-γR,從而抑制CD8+Treg介導的前房相關免疫偏離(anterior chamber-associated immune deviation,ACAID)[10]。局部結膜下注射微量SP能夠模擬SLIP反應,而應用SP受體拮抗劑Spantide Ⅱ能夠抑制SLIP,降低對側眼角膜移植排斥反應的發生,進一步提示角膜神經參與病理因素誘導的SLIP[11]。

角膜感覺神經除了介導雙眼角膜之間的SLIP,也可影響雙眼結膜的免疫耐受。盡管結膜含有豐富的血管、淋巴管系統及大量的免疫相關細胞,但結膜上皮細胞通過調控特異性Treg,維持生理狀態下相對的免疫耐受狀態。Guzmán等[12]報道,單眼角膜堿燒傷導致對側眼結膜免疫耐受的消失,進一步研究證實,堿燒傷眼通過瞬時受體電位香草醛1(transient receptor potential vanilloid1,TRPV1)信號通路促進對側眼表神經末梢SP釋放,依次活化結膜上皮細胞NF-κB通路,促進抗原提呈細胞(DC)的活化。然而,與正常對照組相比,對側眼結膜組織中TNF-α和IL-1β等促炎因子的表達無明顯變化,提示結膜免疫耐受的喪失與局部炎癥狀態無關。此外,特異性標記抗原局部結膜下注射后追蹤研究顯示,雙眼角膜及結膜之間不存在免疫交聯的解剖結構,從而進一步證實角膜感覺神經介導雙眼角膜及結膜免疫赦免交感性丟失。

總而言之,感覺神經纖維通過神經反射弧將雙眼連接成一個相互作用、相互影響的功能單位。然而,如何通過調控TRPV1及SP等關鍵的調控因子提高角膜移植后植片的存活率,對于角膜移植及眼表其他組織移植的臨床意義重大,仍需要更深層次的探索詳細闡述其原理。

2 角膜神經與角膜新生血管

神經系統和血管系統相互伴行,通過相似且復雜的分支模式,呈網絡樣分布于機體組織器官,并且神經系統和血管系統共用許多信號導向分子,如Neuropilin、Netrins、Slits、Semaphorins、Ephrins、Neurotrophins、HGF及VEGF等,精確地調控它們各自的發生、生長和走行方向,這種解剖結構及分子生物學基礎決定了它們在生理及病理狀態下互動協作或相互調控[13]。既往研究發現,脊索神經元表達sFlt1,抑制局部VEGFaa-KDR通路介導的脊索旁血管網的出芽生長,從而調控脊索特殊的血管空間分布模式[14];視網膜神經元通過表達VEGFR2中和局部VEGF信號,抑制視網膜神經纖維層異常血管的形成[15]。由此可見,機體神經纖維參與調控組織器官特異性的血管生長及分布模式。

角膜特異性的血管生長與分布模式表現為角膜緣豐富的血管分支相互吻合,形成角膜緣血管網,但角膜組織卻缺乏血管[16],即角膜“無血管”特性,它是維持角膜透明的基礎,對于正常的視覺功能至關重要[17]。各種病理因素損害角膜三叉神經纖維,造成神經營養性角膜病變(neurotropic keratopathy,NK),此類患者更容易發生角膜新生血管化,導致角膜“無血管”特性的喪失;電凝或手術切除小鼠三叉神經節,這種去神經效應刺激角膜新生血管的快速生長,同樣導致角膜“無血管”特性的丟失[18],提示角膜感覺神經纖維參與維持角膜“無血管”特性,但其分子調控機制尚不清楚。

然而,在病理因素刺激下,受損的角膜感覺神經末梢釋放神經肽SP及CGRP等,促進局部炎癥反應,從而促進角膜新生血管(corneal neovascualrization,CNV)形成[19]。Barbariga等[20]研究發現,CNV患者淚液SP表達明顯升高,且SP水平與CNV嚴重程度呈正相關。另有研究利用Tac1-knockout(KO)小鼠模型進行動物實驗研究證實,剝奪SP的表達能夠抑制CNV的形成,選擇性阻斷SP特異性受體NK1R,能夠明顯降低CNV及新生淋巴管的生成(分別減少33%和51%)[21]。

CGRP是一種來源于感覺神經末梢的含有37個氨基酸的神經肽。CGRP陽性神經纖維占整個三叉神經節約31%及占角膜中央基底下神經纖維的70%,角膜感覺神經來源的CGRP呈現促血管生成作用[22-23]。將三叉神經元和血管內皮細胞(VEC)共培養,阻斷神經元條件培養基中的CGRP信號通路導致VEC遷移和新生血管減少。結膜下注射CGRP拮抗劑CGRP8-37可減少CNV和淋巴管生成,伴隨中性粒細胞等炎癥細胞浸潤減少,提示角膜感覺神經通過釋放CGRP調控炎癥性CNV生長[24]。

盡管角膜神經來源的CGRP和SP呈現相似的促炎癥性CNV生長,但是它們在神經調節CNV生長過程中的相互作用研究較少。SP和CGRP對于體外培養的肺動脈內皮細胞的生長具有協同效應[25]。將正常、非炎癥的三叉神經元與VEC共培養,阻斷培養體系中CGRP的信號通路則導致VEC活性降低,提示CGRP可能是生理狀態下的關鍵促血管生成因子。然而,CGRP拮抗劑CGRP8-37并不能阻斷SP誘導的血管生成,表明SP通路在調控CNV形成過程中獨立于CGRP通路。相反,使用NK1R拮抗劑Spantide Ⅰ阻斷SP通路,能夠抑制CGRP促VEC成管效應,提示CGRP的促血管生成作用可能部分通過SP/NK1R信號通路產生效應[26]。

3 角膜神經與角膜緣干細胞巢微環境

成體干細胞或組織特異性干細胞(adult stem cells,ASCs)定居于局部解剖結構明顯不同且功能高度特異的巢結構。ASCs巢整合并翻譯來自局部及遠端位點的信號,并特化為特定的巢微環境,以維持ASCs群自身靜止、活化及自我更新[27]。ASCs巢微環境受到精密的調控以維持宿主組織器官穩態。近年研究發現,神經纖維網整合機體內外環境信號,通過釋放神經遞質或神經肽小分子參與調控ASCs巢微環境,維持正常ASCs及腫瘤干細胞的增殖與分化[28]。角膜緣干細胞(limbal stem cells,LSCs)定位于角膜緣巢結構,來源于三叉神經眼支的角膜感覺神經纖維密集分布于此,這種解剖結構基礎預示其在調控LSCs巢微環境中擔負重要功能。病毒感染、顱腦腫瘤或創傷及糖尿病等損傷三叉神經纖維,引起神經營養性角膜病變(neurotrophic keratopathy,NK),主要表現為LSCs干性標記降低、持續性上皮缺損,最終造成難治性致盲性眼病[29]。LSCs是角膜上皮細胞增殖的源泉,NK所發生的角膜上皮功能異常一定程度上反映了失神經支配引起的LSCs生物學特性的變化。實驗性電凝小鼠三叉神經眼支造成角膜去感覺神經支配,導致LSCs數量明顯減少,來源于去神經角膜緣的干/祖細胞克隆形成率明顯降低[30]。上述研究報道提示,角膜感覺神經纖維參與調控角膜緣巢微環境以維持LSCs的生物學特性,從而維持角膜上皮的更新穩態和完整性。

然而,角膜感覺神經如何調控LSCs的生物學特性?這其中的分子調控機制尚不清楚。Okada等[31]觀察角膜去三叉神經小鼠發現,去三叉神經導致小鼠角膜上皮愈合受損及外周/角膜緣上皮細胞增殖降低,LSCs干性標記表達降低;基因敲除TRPV4抑制LSCs干性標記表達,而利用病毒載體補充表達TRPV4能夠恢復去神經引起的LSCs干性標記的表達異常,提示角膜感覺神經纖維可能通過TRPV4調控LSCs干性。最近研究發現,三叉神經節感覺神經元通過釋放SP,上調角膜緣基底上皮細胞N-cadherin的表達,而SP拮抗劑能夠抑制N-cadherin的表達上調。N-cadherin既是LSCs的特異性標記,成簇表達于角膜緣基底上皮細胞,又是重要的黏附分子介導干細胞與巢成分間的相互作用[32]。此外,N-cadherin通過胞漿區結合β-catenin形成N-cadherin/β-catenin復合體,作為β-catenin的儲存庫,調控胞漿中β-catenin水平,進而影響Wnt/β-catenin通路靶基因的表達[33]。N-cadherin與β-catenin共存于許多神經干細胞巢,協同調控神經干/祖細胞的自我更新與分化[34];shRNA干擾N-cadherin的表達,引起Wnt/β-catenin信號下調,導致鼠腦皮質神經干細胞干性丟失和過早分化[35]。由此推測,SP/N-cadherin/β-catenin通路可能作為角膜感覺神經調控LSCs或LSCs巢微環境的潛在靶向分子信號通路。

值得注意的是,角膜感覺神經可能參與病理因素引起的“LSCs交感性損傷”。Liu等[36]研究發現,單眼單純皰疹病毒性角膜炎(herpes simplex keratitis,HSK)和帶狀皰疹病毒性角膜炎(herpes zoster keratitis,HZK)導致對側眼角膜上皮層變薄,LSCs巢結構異常,而且對側眼LSCs及巢結構的異?；驌p傷與角膜神經纖維的改變明顯相關。從而提示,角膜感覺神經不僅介導損傷刺激誘導的SLIP,同時可能參與病理因素引起的LSCs交感性損傷。

4 角膜神經與神經源性炎癥反應

角膜神經源性炎癥(neurogenic inflammation,NI)是指傷害性刺激損害角膜神經,導致神經分泌因子或神經肽的釋放,引起局部血管擴張及通透性增加,致血-組織屏障破壞、角膜水腫和白細胞募集和激活[37]。盡管NI最初的啟動是有益的,可以刺激免疫反應和對抗感染。然而,長時間和/或過度的反應導致嚴重的炎癥狀態,進而引起過度的炎癥反應,形成惡性循環,造成組織損傷[38]。

角膜感覺神經系統和自主神經系統(主要是交感神經末梢)都參與NI的啟動[6]。感覺神經纖維來源的神經肽不僅激活先天免疫系統,還激活獲得性免疫系統,特別是作用于表達神經肽受體的T細胞,進而誘導促炎細胞因子的釋放,如IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α和INF-γ[39]。更為值得關注的是,感覺神經纖維同時也表達促炎因子和前列腺素的受體,如TNF-α、IL-6、IL-1β和前列腺素-E2(PGE2)受體,提示感覺神經與周圍促炎環境之間存在雙向反饋調控[40],而且,這種外周組織中神經纖維與免疫細胞的相互作用僅受到局部環境信號調控,并不受制于中樞神經系統[41]。急性角膜化學傷是臨床觀察和探究神經源性炎癥的最佳模型。角膜化學燒傷即刻造成嚴重的神經損傷,角膜組織及三叉神經節SP及其受體NK1R表達明顯升高,伴隨增高的白細胞浸潤[42];選擇性損傷角膜神經,能夠引起與化學傷相似的SP和NK1R的表達也增加,提示角膜化學傷引起的炎癥反應與神經損傷直接相關。在干眼等其他眼部炎癥性疾病中,表現出一種類似的神經源性炎癥和新生血管生成等病理過程的交叉混雜[43]。

自主神經系統同樣參與損傷刺激引起的神經源性炎癥反應。交感神經釋放兒茶酚胺類神經遞質,直接激活中性粒細胞和NK細胞表面α和/或β腎上腺素能受體,調節炎癥相關細胞或免疫細胞的功能活動,誘導細胞因子/趨化因子包括TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12、INF-γ、細胞間黏附分子1(ICAM-1)、E選擇素等的產生和釋放,調節白細胞趨化、細胞毒性、吞噬和抗原提呈等功能。此外,交感神經系統調控不同T、B淋巴細胞亞群的分化、遷移和效應器功能,從而調節獲得性免疫。與之相反,副交感神經系統(PSNS)釋放乙酰膽堿遞質,刺激IL-10的釋放,從而平衡或抑制交感神經過度活化引起的炎癥反應[44]。

事實上,NI發生過程中,感覺神經系統與自主神經系統并不是獨立的互不干涉的存在,兩者相互作用,感覺神經末梢的激活伴隨著自主神經系統精細的調控反應。研究顯示,脾、肝、胃腸道和心臟都存在炎癥反射弧,其中感覺神經纖維作為信號傳入弧,接收和整合細胞因子或病原體衍生產物的激活刺激,而自主神經系統作為傳出弧,介導效應器的活化及炎癥反應的發生[45]。盡管這種炎癥反射弧在角膜組織中存在與否尚未得到證實,但阻斷角膜感覺傳入信號能夠降低自主神經系統的炎癥反應。不容忽視的是,單側角膜神經損傷引起的NI導致對側炎癥反應[12],但這種交叉效應的解剖途徑仍不清楚。腦干區三叉腦干感覺復合體(the trigeminal brainstem sensory complex,TBSC)等中樞調控區是否參與NI的交叉反應仍需進一步研究證實。

5 角膜神經與創傷愈合

角膜傷口愈合是一個涉及角膜上皮、基質細胞、血管內皮細胞、炎癥細胞等共同參與的復雜過程。角膜神經通過分泌生長因子和神經肽如SP、CGRP 和NGF,有效協調這些參與者的活動并最終影響傷口愈合過程[46]。感覺神經末梢釋放的SP在胰島素生長因子(IGF)的協同作用下,刺激角膜上皮細胞黏著斑復合物(蛋白激酶 C、p38 MAPK 激活和α5 整合素)的形成,促進上皮遷移和黏附。此外,SP促進上皮細胞和基質細胞合成及釋放IL-8,從而促進細胞遷移[47]。角膜神經的再生則可以加速角膜傷口愈合,也進一步支持角膜神經在角膜傷口愈合過程中的重要作用[48]。CGRP陽性神經纖維的再生加速角膜上皮愈合,提示CGRP陽性神經纖維參與角膜上皮創傷修復[49]。副交感神經末梢釋放血管活性肽(vasoactive-intestinal-peptide,VIP)通過Shh(Sonic Hedgehog)通路調控角膜上皮愈合[50]。然而,交感神經兒茶酚胺遞質在傷口閉合中的作用仍存在爭議。

角膜神經在角膜基質創傷愈合中的作用尚未完全闡明。角膜急性堿燒傷后,SP可刺激CD29+基質細胞動員并募集到受損組織位點,加速傷口愈合。自主神經系統(交感神經或副交感神經)和炎癥細胞在創傷局部原位相互作用,推進角膜創傷的成功愈合。

6 小結

角膜是人體內神經最密集的組織之一,角膜神經參與調控局部免疫誘導、CNV形成、LSCs分化及眼表創傷愈合等重要病理生理過程。隨著先進檢測技術的應用及角膜去三叉神經模型的建立,對于角膜神經纖維功能效應的研究將會進一步深入,角膜神經纖維與LSCs、角膜上皮細胞、角膜基質細胞、角膜免疫細胞之間的相互作用也將被闡明,而闡明這些問題對于角膜及眼表疾病的診斷及治療具有重要的指導意義。