FasL抑制劑對大鼠角膜移植術后角膜細胞凋亡及Treg的影響

曹 倩,李 蘭,李 勇,李云川,鄒 瑩,龍俊君,何柳余,劉浩文

目的:探索大鼠角膜移植術后玻璃體腔內注射FasL抑制劑對角膜細胞凋亡,角膜Fas、FasL表達,全血和頸部淋巴結中Treg數量及排斥反應指數的影響。

方法:將24只SD大鼠24眼行穿透性角膜移植術,術后隨機分為玻璃體腔內注射PBS組(12只12眼)、FasL抑制劑組(12只12眼),每周記錄角膜排斥反應指數,術后1、3、5wk取全血、頸部淋巴結檢測Treg數量,取角膜組織測Fas、FasL表達及凋亡細胞數量。

結果:FasL抑制劑組角膜Fas、FasL表達較PBS組明顯下降(均P<0.05);FasL抑制劑組角膜細胞凋亡較PBS組明顯減少,FasL抑制劑組術后5wk凋亡最少;術后3wk開始FasL抑制劑組Treg數量較PBS組明顯升高(均P<0.05),FasL 抑制劑組角膜移植排斥反應評分明顯低于PBS組(均P<0.05)。

結論:大鼠角膜移植術后玻璃體腔內注射FasL抑制劑可減少角膜各層細胞凋亡,增加全血、頸部淋巴結中Treg的數量,減輕排斥反應。

?KEYWORDS：FasL inhibitor; corneal transplantation; rejection; Treg

0 引言

角膜移植術是終末期角膜疾病患者復明的唯一方式,但每年手術不足萬例,相對于亟待手術的400萬角膜盲患者來說是杯水車薪。目前我國角膜植片的主要來源是心臟死亡供體捐獻(donation after cardiac death,DCD)的角膜。在供體角膜植片極度缺乏的情況下對于角膜新生血管、角膜穿孔等高危角膜移植術排斥反應率高達50%[1],最終患者視力糾正不佳甚至再次失明。因此探索角膜移植排斥反應的發生機制尤為迫切。排斥反應是多因素參與的復雜免疫反應,其發生機制目前仍不十分清楚。既往認為主要是T細胞介導的遲發型超敏反應,細胞凋亡不會引起排斥反應,但近年來研究表明[2-4]在同種異體器官移植中,細胞凋亡與移植后的急、慢性排斥反應有密切的聯系。Fas信號途徑與FasL結合后,表達Fas的細胞被誘導發生凋亡。角膜移植術后Fas和FasL可見在上皮細胞層、基質層、內皮細胞層表達,且Fas和FasL表達程度與排斥反應程度呈正相關[5]。近期的研究表明Treg細胞在角膜移植免疫排斥反應中扮演重要角色[6],通過增加小鼠體內的Treg細胞數量可降低排斥反應率[7]。為了解Fas途徑介導角膜細胞凋亡后Treg細胞的變化情況,本研究建立心臟死亡供體大鼠角膜移植模型后,將FasL抑制劑注射到玻璃體腔內,觀察角膜植片細胞凋亡情況及排斥反應,并檢測大鼠全血、頸部淋巴結中Treg數量。旨在為角膜移植排斥反應的防治提供一定的實驗依據。

1 材料和方法

1.1材料選取體質量為220～250g的雄性8～10周齡SD大鼠,動物由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供,江蘇美迪森生物醫藥有限公司有限公司供應飼料,飼養環境為清潔級,適應性飼養1wk后進行實驗。本實驗經昆明市第一人民醫院醫學倫理委員會動物實驗倫理審批(No.YLS2020-119),符合動物倫理。

試劑:PE/Cyanine7 anti-rat CD4 Antibody(Biolegend公司),PE anti-mouse/rat/human FOXP3 Antibody(Biolegend公司),FITC anti-rat CD25 Antibody(Biolegend公司),FasL抑制劑(Selleck公司),TUNEL試劑盒(Roche公司),Fas抗體(Abcam公司),FasL抗體Abcam公司)。

1.2方法

1.2.1角膜移植模型建立12只SD大鼠建立心臟死亡模型[8]后取雙側眼角膜作為供體植片,24只SD大鼠作為受體,選取右眼作為手術眼。采用硬幣法隨機分為兩組:PBS組(12只12眼):術畢玻璃體腔內注射PBS注射液1IU;FasL抑制劑組(12只12眼):術畢玻璃體腔內注射FasL抑制劑1IU(10μg)。術畢結膜囊內點妥布霉素眼膏,6-0縫線縫合眼瞼中部,術后24h剪開眼瞼縫線,點妥布霉素眼膏,每天1次,連續使用1wk。

1.2.2角膜移植術后排斥反應評分術后用體視鏡每天觀察術眼角膜混濁、水腫、新生血管情況,由同一醫生根據表1進行排斥反應評分,三項評分之和為排斥反應指數(rejection index, RI),當RI≥6,確定為排斥[9]。

表1 角膜移植術后排斥反應評分標準

1.2.3流式細胞術分別于術后1、3、5wk處死每組大鼠各4只,取心臟全血、頸部淋巴結,提取出單個細胞后用流式細胞術檢測Treg數量。

1.2.4 TUNEL染色取角膜組織用TUNEL染色檢測角膜細胞凋亡數量:每張切片任意取5個高倍視野同時對每個視野陽性細胞數進行計數。凋亡指數=陽性細胞數/有核細胞總數×100%。

1.2.5免疫熒光染色石蠟包埋角膜組織切片后用免疫熒光染色法測Fas/FasL表達情況:Fas(綠色染色為陽性染色)、FasL(紅色染色為陽性染色)。陽性結果使用Image pro plus軟件,每張圖片取5個高倍視野進行統計。陽性表達率=陽性區域面積/總面積×100%。

2 結果

2.1術后不同時間角膜Fas和FasL含量比較PBS組術后不同時間角膜Fas含量比較差異有統計學意義(F=47.52,P=0.0016),術后3、5wk與術后1wk比較差異均有統計學意義(P<0.05)。FasL抑制劑組術后不同時間角膜Fas含量比較差異無統計學意義(F=2.581,P=0.1906)。PBS組術后不同時間角膜FasL含量結果比較差異無統計學意義(F=3.79,P=0.1193)。FasL抑制劑組術后不同時間角膜FasL含量結果比較差異無統計學意義(F=1.036,P=0.434)。術后1、3、5wk兩組間Fas和FasL含量比較差異均有統計學意義(P<0.05),見圖1,表2、3。

圖1 術后不同時間免疫熒光染色法檢測Fas和FasL表達情況 藍色:DAPI細胞核染色;綠色:Fas陽性表達;紅色:FasL陽性表達。

表2 術后不同時間角膜Fas含量比較

表3 術后不同時間角膜FasL含量比較

2.2術后不同時間角膜凋亡指數比較PBS組術后不同時間角膜凋亡指數比較差異有統計學意義(F=8.167,P=0.0387),術后5wk與術后1wk比較差異有統計學意義(P<0.05)。FasL抑制劑組術后不同時間角膜凋亡指數比較差異有統計學意義(F=49.53,P=0.0015),術后3、5wk與術后1wk比較差異均有統計學意義(P<0.05)。術后1、3、5wk兩組間角膜凋亡指數比較差異均有統計學意義(P<0.05),見圖2,表4。

圖2 術后不同時間TUNEL染色檢測角膜細胞凋亡情況 棕黃色染色為凋亡染色陽性細胞。

表4 術后不同時間角膜凋亡指數比較

2.3術后不同時間全血和頸部淋巴結Treg數量比較PBS組術后不同時間全血Treg數量比較差異有統計學意義(F=77.52,P=0.0006),術后3、5wk與術后1wk比較差異均有統計學意義(P<0.05);術后5wk與術后3wk比較差異有統計學意義(P<0.05)。FasL抑制劑組術后不同時間全血Treg數量比較差異有統計學意義(F=34.96,P=0.0029),術后3、5wk與術后1wk比較差異有統計學意義(P<0.05);術后5wk與術后3wk比較差異有統計學意義(P<0.05)。術后1wk,兩組間全血Treg數量比較差異無統計學意義(P>0.05);術后3、5wk,兩組間全血Treg數量比較差異均有統計學意義(P<0.05),見表5,圖3A。

圖3 術后不同時間流式細胞術檢測Treg比例 A:全血Treg檢測結果;B:頸部淋巴結Treg檢測結果。

表5 術后不同時間全血Treg數量比較

PBS組術后不同時間頸部淋巴結Treg數量比較差異有統計學意義(F=18.44,P=0.0096),術后5wk與術后1、3wk比較差異均有統計學意義(P<0.05)。FasL抑制劑組術后不同時間頸部淋巴結Treg數量比較差異有統計學意義(F=790.1,P<0.0001),術后3、5wk與術后1wk比較差異均有統計學意義(P<0.05);術后1wk,兩組間頸部淋巴結Treg數量比較差異無統計學意義(P>0.05);術后3、5wk,兩組間頸部淋巴結Treg數量比較差異均有統計學意義(P<0.05),見表6,圖3B。

表6 術后不同時間頸部淋巴結Treg數量比較

2.4術后不同時間角膜植片排斥反應評分比較PBS組術后不同時間角膜植片排斥反應評分比較差異有統計學意義(F=10.44,P=0.0036),術后3、5wk與術后1wk比較差異均有統計學意義(P<0.05)。FasL抑制劑組角膜植片排斥反應評分比較差異有統計學意義(F=4.488,P=0.0406),術后5wk與術后1wk比較差異有統計學意義(P<0.05)。術后1wk,兩組間角膜植片排斥反應評分比較差異無統計學意義(P>0.05),術后3、5wk,兩組間角膜植片排斥反應評分比較差異均有統計學意義(P<0.05),見表7,圖4。

圖4 體視顯微鏡觀察兩組術后不同時間移植角膜植片圖。

表7 術后不同時間角膜植片排斥反應評分比較 分)

3討論

角膜移植術后排斥反應的有效防治是臨床工作中關注的重點和難點,然而角膜移植術后排斥反應是多因素共同作用的復雜機制,至今仍未完全明了。近年來的研究表明細胞凋亡與移植術后的排斥反應有密切關系。角膜移植術后內眼微環境改變,眼前段免疫赦免機制受到破壞,大量炎性細胞存在于角膜植片及房水中。角膜基質細胞受刺激后分泌FasL,形成上皮-基質,基質-基質的旁分泌和自分泌Fas/FasL體系,介導和調控基質細胞凋亡。上皮和內皮細胞通過分泌FasL,既可以通過自分泌方式作用于自身,也可以通過旁分泌作用于基質細胞,介導細胞的凋亡。FasL抑制劑是否會減少角膜植片基質細胞的凋亡?Fas細胞凋亡抑制分子已被確定為Fas信號傳遞的負調控因子,隨后被發現在許多生理過程中發揮多方面的作用[10]。

既往研究表明在小鼠前房內注射Fas受體的小肽抑制劑ONL1204通過抑制Fas信號通路,在誘導型青光眼小鼠模型中提供強大的神經保護,可以減少視網膜神經節細胞的凋亡,防止青光眼發病機制中多種炎癥通路的誘導[11]。Zacks等[12]發現阻斷Fas受體的激活,可以防止在面對急性氧化應激時的視網膜色素上皮損傷,除了減少與年齡相關性黃斑病變過程相關的炎癥反應外,還能直接抑制細胞死亡,表明FasL抑制劑無視網膜毒性。本研究使用心臟死亡供體同種類SD大鼠供體進行角膜移植模型構建,在術后14d均出現排斥反應[8]。大鼠前房極淺,角膜移植術畢需要前房內注射空氣形成前房,反復進行前房的注射操作容易造成藥物滲漏,并發性白內障、角膜內皮損傷等,因此我們參照Zacks等[12]方法用FasL抑制劑進行玻璃體腔注射,探討FasL抑制劑在減輕角膜移植排斥反應中的作用機制。

近年來,發現角膜的免疫赦免地位與Fas/FasL系統密切相關[13],Fas、FasL是人體細胞表面的一種膜蛋白,二者結合后可在短短數小時內誘發細胞凋亡。Fas屬于腫瘤壞死因子—神經生長因子受體家族Ⅰ型膜蛋白,是由325個氨基酸組成的分子量為45kD的細胞膜表面受體蛋白。FasL是分子量約為40kD的Ⅱ型膜蛋白,細胞外區約有150個氨基酸與TNF家族成員同源。許多組織及細胞均有一定的Fas表達,研究證實在活化的成熟淋巴細胞中Fas表達增高,FasL表達局限,常見于活化的T淋巴細胞,也在部分睪丸和眼組織表達。

急性排斥反應發生時,角膜植片邊緣及中央與正常角膜相比Fas和FasL蛋白表達均呈現上升趨勢,表達于上皮層及淺基質層,距植片邊緣0.5mm內均較中央區域表達高[14]。既往研究結果提示Fas系統與凋亡在排斥反應過程中扮演了重要角色一致,推測可能是外來抗原激活了體內的免疫因子或細胞,它們可誘發局部角膜組織Fas及FasL的異常表達,進而使Fas系統途徑介導的細胞凋亡的異常發生,造成組織損害,將引發或促進移植排斥反應的發生發展[12]。

本實驗中角膜移植術畢玻璃體腔注射FasL抑制劑后分別于術后1、3、5wk檢測角膜組織Fas、FasL的表達,與PBS組相比均有不同程度下降。FasL抑制劑組角膜組織的Fas、FasL含量術后1、3、5wk差異不明顯,表明FasL抑制劑對降低角膜組織中Fas、FasL的含量的作用穩定。檢測角膜凋亡細胞數量,FasL抑制劑組較PBS組明顯下降。術后3wk開始效果明顯,持續至術后5wk,且FasL抑制劑組從術后3wk開始排斥反應評分低于PBS組。提示玻璃體腔注射FasL抑制劑可減少角膜全層細胞的凋亡,減少排斥反應評分。

當眼部組織發生感染、過敏、自身免疫病等炎癥反應時Treg細胞也遷移至病灶部位,發揮抗炎作用,抑制病程進展[15-18]。有研究檢測小鼠行同種異體角膜移植術后免疫耐受與發生排斥的小鼠植片和局部引流淋巴結內Treg細胞的數量及功能,證實了Foxp3+Treg細胞參與了眼局部角膜移植術后免疫耐受[17]。

本實驗中檢測到FasL抑制劑組、PBS組在術后1wk全血Treg數量差異不顯著,術后3wk開始FasL抑制劑組較PBS組明顯升高,術后3、5wk FasL抑制劑組頸部淋巴結中Treg數量較PBS組明顯升高,排斥反應評分較PBS組低,且術后5wk排斥反應評分與術后3wk相比無統計學差異,表明玻璃體腔注射FasL抑制劑于術后3wk開始出現明顯抗排斥作用,且一直維持至術后5wk。可能與角膜移植術后Treg經引流淋巴結遷移至炎癥部位發揮作用有關。文獻顯示當Fas與FasL以三聚體形式結合時,可激活細胞內Fas死亡信號系列的活性,誘導表達Fas的細胞發生凋亡[15],角膜移植術后玻璃體腔注射的FasL抑制劑為分子量460.34kD的小分子化合物,可通過血房水屏障進入血液系統,抑制了Treg表面Fas與FasL的結合,從而減少Treg細胞凋亡。抑制Fas系統分子的過度表達,可能是排斥反應防治的有效途徑。近年不少研究者提出通過調控Treg細胞來誘導免疫耐受的免疫治療具有良好的運用前景[19],主要為增加體內Treg數量,誘導Treg細胞遷移至病灶來降低排斥[7]。CD4+CD25+Treg僅占外周血及脾臟CD4+T細胞的5%～10%,數量較少,本研究從減少角膜移植術后Treg細胞凋亡方面著手,為角膜移植排斥反應的治防治提供了新思路。

本實驗結果提示大鼠角膜移植術后玻璃體腔注射FasL抑制劑3wk后可減少大鼠移植角膜細胞的凋亡,提高Treg細胞含量,提高移植物免疫耐受,減少排斥反應。但到目前為止,還沒有鑒定出與Fas細胞凋亡抑制分子相互作用的蛋白,這使得我們很難確定其結構和準確理解其功能的分子機制[10]。因此,未來迫切需要識別Fas細胞凋亡抑制分子在不同生理和病理背景下的相互作用蛋白。FasL抑制劑玻璃體腔注射引起全血和頸部淋巴結Treg升高的具體機制還有待進一步研究。