血清TLR4和VEGFA表達對糖尿病視網膜病變的臨床診斷及預后價值評估

閆秀麗,王 欽,陸相慶

目的:探討Toll樣受體4(TLR4)、血管內皮生長因子A(VEGFA)在糖尿病視網膜病變(DR)患者血清中的表達情況及臨床意義。

方法:選取2021-01/2022-01本院收治的183例2型糖尿病(T2DM)患者為研究對象,分為非糖尿病視網膜病變(NDR)組(54例),增殖性糖尿病視網膜病變(PDR)組(68例)和非增殖性糖尿病視網膜病變(NPDR)組(61例)。同期按照年齡、性別分層隨機選擇70例于本院進行健康體檢志愿者作為對照組。出院后隨訪1a,根據DR患者是否發生視力殘疾,分為預后不良組(40例)與預后良好組(89例)。采用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測血清中TLR4、VEGFA水平;通過Logistic回歸分析DR發生的影響因素;利用受試者工作特征曲線(ROC)分析血清TLR4、VEGFA水平診斷DR及預測預后的臨床價值。

結果:對照組、NDR組、PDR組和NPDR組間TLR4、VEGFA水平比較均具有差異(F=935.753、516.936,均P<0.05),各組兩兩比較均具有差異(P<0.05)。預后不良組患者血清中TLR4、VEGFA表達水平均高于預后良好組(P<0.01)。Logistic回歸分析結果顯示,TLR4、VEGFA、病程、HbA1c均是DR發生的危險因素(P<0.05);ROC結果顯示,血清TLR4、VEGFA水平及二者聯合預測DR的AUC分別為0.869、0.862、0.931,血清TLR4、VEGFA水平及二者聯合預測DR患者視力殘疾的AUC分別為0.864、0.863、0.938。

結論:DR患者血清中TLR4、VEGFA表達均上調,二者聯合檢測可作為評估DR發生及預后不良的潛在指標。

?KEYWORDS：diabetic retinopathy; Toll-like receptor 4 (TLR4); vascular endothelial growth factor A (VEGFA)

0 引言

糖尿病(diabetes mellitus,DM)是一種伴多種并發癥的代謝綜合征,近幾十年來在世界范圍內的患病率呈上升趨勢[1]。糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy,DR)是DM的主要并發癥,可導致視網膜血管異常和嚴重的視力損害[2-3]。DR發病的確切分子機制尚不清楚,治療選擇也有限[4]。因此,迫切需要發現新的治療靶點和發展早期檢測方法來治療和預防DR。血清Toll樣受體4(toll like receptor 4,TLR4)是Toll樣受體家族(toll-like receptor,TLR)蛋白的一員,是促炎反應的主要參與者[5]。研究發現TLR4與2型糖尿病(diabetes mellitus type 2,T2DM)患者微血管并發癥的發生、發展有著密切的聯系[6]。血管內皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)是一種血管生成的主要激活劑,被認為通過誘導新生血管和增加視網膜血管的通透性來發揮重要作用[7]。兩種因子均與DR相關,但二者對DR的診斷及預后價值尚不明確。基于此,本研究旨在通過檢測TLR4、VEGFA在DR患者中的表達情況,分析TLR4、VEGFA與DR發展及預后預測的作用,旨在為DR的早期預防和治療提供參考依據。

1 對象和方法

1.1對象選取2021-01/2022-01本院收治的183例T2DM患者為研究對象,根據有無DR分為DR組(129例)和非糖尿病視網膜病變(NDR)組(54例),根據DR的國際臨床分類將DR患者分為增殖性糖尿病視網膜病變(proliferative diabetic retinopathy,PDR)組(68例)和非增殖性糖尿病視網膜病變(non-proliferative diabetic retinopathy,NPDR)組(61例)。同期按照年齡、性別分層隨機選擇70例于本院進行健康體檢志愿者作為對照組。納入標準:(1)符合T2DM診斷標準[8];(2)使用光學相干斷層掃描和眼底熒光血管造影檢查T2DM患者,診斷是否存在DR[9];(3)患者均為雙眼發病。排除標準:(1)孕期、哺乳期或兩者兼而有之的非糖尿病原因導致的視力喪失;(2)診斷為癌癥、免疫系統疾病;(3)合并其他眼部疾病者,如視網膜血管阻塞、動脈粥樣硬化、高血壓、血液病或糖尿病眼底病變,視網膜脫離、視網膜腫瘤或其他相關疾病;(4)使用抗代謝物或免疫抑制劑;(5)臨床資料不完整者。本研究經我院倫理委員會批準,并向入組受試者告知研究情況并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1標本采集從每位同意的患者身上采集大約10mL空腹靜脈血,放入血清分離管。血液樣品凝固30min,然后在固定角度離心機中以1300×g離心15min。然后分離血清,并立即在-80℃保存,以待進一步研究。

1.2.2酶聯免疫吸附法檢測血清中TLR4和VEGFA水平采用酶聯免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)根據制造商的說明,使用TLR4(貨號EK-H10214,EK-Bioscience)和VEGFA檢測試劑盒(貨號KIT11066,Sino Biological Inc.)測定TLR4、VEGFA的水平。

1.2.3臨床資料收集及生化指標測定從我院病歷管理系統中收集患者的姓名、性別、年齡、體質量指數(body mass index,BMI)、住院次數、糖尿病病程、糖尿病家族史、身高、體質量、收縮壓和舒張壓(入院當天,充分休息后,由我科護士用電子血壓計測量血壓)等資料。采用全自動生化分析儀測定血清糖脂代謝指標,包括空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)水平,采用放射免疫法測定空腹胰島素(fasting insulin,FINS)水平。

1.2.4預后隨訪DR患者均進行規范化治療,治療方法參考《我國糖尿病視網膜病變臨床診療指南(2014年)》[9]。出院后均進行隨訪,為期1a,用標準對數遠視力表根據患者是否發生視力殘疾[10],分為預后不良組(40例)與預后良好組(89例)。

2 結果

2.1一般資料比較各組年齡、性別、BMI、收縮壓、舒張壓、LDL-C、TC水平比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。與對照組比較,NDR組、NPDR組、PDR組血清中HbA1c、FBG、FINS、TG水平均升高,HDL-C水平均降低,差異均有統計學意義(P<0.05);與NDR組比較,NPDR組病程、HbA1c、TG水平均升高,PDR組病程、FINS水平均升高,差異均有統計學意義(P<0.05),見表1。

表1 一般資料比較

2.2各組血清中TLR4和VEGFA水平比較四組間TLR4、VEGFA水平比較,差異均具有統計學意義(P<0.01)。與對照組比較,NDR組、PDR組、NPDR組患者血清中TLR4、VEGFA水平均升高(P<0.05);與NDR組比較,PDR組和NPDR組患者血清中TLR4、VEGFA水平均升高(P<0.05);與NPDR組比較,PDR組患者血清中TLR4、VEGFA水平均升高(P<0.05),見表2。

表2 各組血清中TLR4和VEGFA表達水平

2.3影響DR發生的危險因素分析以是否發生DR為因變量,以TLR4、VEGFA、病程、HbA1c、FINS、TG為自變量,進行Logistic回歸分析,結果顯示,TLR4、VEGFA、病程、HbA1c均是DR發生的危險因素(P<0.05),見表3。

表3 多因素Logistic回歸分析

2.4 ROC曲線分析血清中TLR4和VEGFA預測DR發生的診斷價值以發生DR患者(NPDR組和PDR組)和未發生DR患者(NDR組)的TLR4、VEGFA數據作ROC曲線。ROC結果顯示,血清TLR4、VEGFA水平預測DR發生的AUC分別為0.869(95%CI:0.812～0.915)、0.862(95%CI:0.909～0.980),最佳截斷值分別為:16.82ng/L、92.32pg/mL,對應的敏感度分別為83.72%、82.95%,特異度分別為79.63%、88.89%,血清TLR4、VEGFA水平聯合預測的AUC為0.931(95%CI:0.884～0.963),較血清中TLR4、VEGFA單獨檢測的AUC升高,敏感度為82.17%,特異度為94.44%,見圖1。

圖1 血清TLR4及VEGFA水平預測DR發生的ROC曲線。

2.5不同預后患者血清中TLR4和VEGFA水平比較預后不良組患者血清中TLR4、VEGFA表達水平均高于預后良好組,差異均有統計學意義(P<0.01),見表4。

表4 兩組血清中TLR4和VEGFA表達水平

2.6 ROC曲線分析血清中TLR4及VEGFA預測DR患者視力殘疾的預測價值ROC結果顯示,血清TLR4、VEGFA水平預測DR患者視力殘疾的AUC分別為0.864(95%CI:0.793～0.918)、0.863(95%CI:0.792～0.917),最佳截斷值分別為25.21ng/L、136.84pg/mL,對應的敏感度分別為85.00%、80.00%,特異度分別為83.15%、89.89%,血清TLR4、VEGFA水平聯合預測的AUC為0.938(95%CI:0.882～0.973),較血清中TLR4、VEGFA單獨檢測的AUC升高,敏感度為80.00%,特異度為97.75%,見圖2。

圖2 血清TLR4及VEGFA水平預測DR患者視力殘疾的ROC曲線。

3 結論

DR是糖尿病最常見的微血管并發癥,也是造成失明的主要原因[11-12]。在NPDR的早期,慢性高血糖會損害供應視網膜的微血管,導致缺血、血管滲漏,以及由糖尿病黃斑水腫引起的中心視力喪失[13]。隨著疾病進展為PDR,會出現與視網膜繼發性新生血管相關的視力喪失,以及隨后的出血、視網膜脫離。先前的研究表明,DR的進展和視力喪失會損害患者的生活質量。如果沒有適當的干預,大約一半的高危PDR患者會在診斷后5a內因糖尿病性黃斑水腫、玻璃體出血、視網膜脫離而出現視力障礙[14]。因此,早期發現和治療對于延緩DR的進展、避免視力喪失和減輕晚期疾病負擔至關重要。

本研究結果顯示,健康人群、NDR組、NPDR組、PDR組血清中HbA1c、FBG、FINS、TG、HDL-C存在顯著差異,提示血糖、血脂代謝異常在DR發生、發展中發揮重要作用,可導致病情加重。

VEGF又稱血管通透性因子,是一種二聚體糖蛋白,其在脊椎動物視網膜發育過程中具有促進生長代謝級聯反應和血管生成的作用[15]。此前,有研究報道下調VEGFA的表達,可用于干預DM引起的視網膜微血管的炎性損傷[16]。本研究中DR患者血清中VEGFA水平顯著高于NDR患者以及健康人群,隨著DR患者預后不良的發生,VEGFA水平逐漸升高,提示VEGFA可能對DR的發生、進展具有促進作用,可以作為預測DR患者預后不良的潛在血清指標。這與姜富國等[17]報道一致。推測其作用機制可能由于慢性高血糖環境可導致體內蛋白質的非酶性糖基化,導致基底膜增厚,甚至引起血管閉塞阻礙氧氣擴散,引起視網膜缺氧,供氧減少和活性氧合成增加可誘導VEGFA的表達,VEGFA介導內皮細胞緊密連接形成和血管舒張的中斷,增加血神經屏障的通透性,從而參與DR的發展[18-19]。血脂升高通過非酶糖基化多元醇途徑引起組織過氧化,導致血管壁損傷和內皮功能障礙。引起血流動力學改變,視網膜組織缺氧,隨之發生微循環障礙,導致動脈粥樣硬化、眼底出血等一系列微血管病變,最終形成微血栓,破壞視網膜屏障,導致DR的發生[20]。ROC結果顯示,血清中VEGFA水平預測DR發生及視力殘疾的AUC分別為0.862、0.863。提示VEGFA水平可在一定程度評估DR發生及預后不良,對盡早診斷DR及改善患者預后提供重要參考依據。

TLR是一個模式識別受體家族,負責炎癥和免疫反應的啟動,可以識別內源性和外源性配體,并與體內各種生理和病理途徑相關[21]。雖然DR的詳細病理生理機制尚不清楚,但越來越多的數據表明,TLR4在DR的發展中起著至關重要的作用[22]。本研究中DR患者血清中TLR4水平高于健康人群,隨著PDR的發生水平逐漸升高,表明TLR4是DR發展過程中的一種重要細胞因子。推測其可能的潛在作用機制為高血糖會促使機體炎癥反應程度加重,導致TLR4分泌增加[22],TLR4信號通路的激活導致下游促炎細胞因子和黏附分子增加,參與炎癥反應[23]的發生,引起血管外滲或血管通透性增加、血管梗阻、新生血管變性和病理改變等病理改變,從而導致DR的發生發展[24-25]。Logistic回歸分析結果顯示,TLR4、VEGFA、病程、HbA1c均是DR發生的危險因素,分析原因是HbA1c作為評估血糖控制情況的重要指標,隨著病程延長,患者血糖控制不佳,導致DR風險增加。此外也提示臨床表現為TLR4、VEGFA高表達的患者,應及時針對制定方案治療,延緩疾病進展;ROC結果顯示,血清TLR4水平預測DR患者視力殘疾的AUC為0.864,二者聯合預測的AUC為0.938。提示TLR4、VEGFA聯合評估DR發生及預后不良的臨床價值優于單一指標。

綜上所述,在DR患者血清中TLR4、VEGFA水平均顯著上調,二者均為DR發生的危險因素,聯合檢測TLR4、VEGFA血清水平可預測DR及預后不良的發生,具有重要的臨床意義。但目前本研究存在局限性,樣本量相對較小,還需要在更大的樣本中進一步驗證。