復合酶法提取魚腥草中黃酮類化合物研究

孫 琛 靳雅楠 李 婷 高學琴 李培然 馮玉冰 孫金旭

（1 衡水市綜合檢驗檢測中心 河北 衡水 053000； 2 衡水學院 河北 衡水 053000）

魚腥草為三白草科蕺菜屬植物，因草帶有魚腥味而得名[1～2]，在我國四川、貴州、云南等地栽培較多，被國家衛健委批準為藥食同源中藥品種，在多種食品、藥品中被廣泛應用。魚腥草中的成分主要為有機酸、揮發油、黃酮類化合物，其中黃酮類化合物無論是從種類還是含量都比較豐富，傳統中醫中藥主要應用魚腥草治療慢性呼吸道疾病、支氣管炎、肺炎等，現代研究表明，魚腥草及其提取物對非典型肺炎、肥胖癥、癌癥、糖尿病、皮膚病等均有治療效果[3]。

復合酶法提取中藥中有效活性成分，需要將細胞中的活性物質釋放到提取的溶液中，為去除阻礙，先需要對植物細胞進行破壁處理[4～8]。組成植物細胞壁的成分多為木質素、果膠質、半纖維素、纖維素等，可以采用生物酶降解技術，或利用纖維素酶、果膠酶，它們能夠破壞細胞壁致密結構，改變通透性，使活性物質從細胞內擴散到提取溶液中，從而使活性成分最大限度地被提取出來。與其它提取方法相比，復合酶提取法具有高效、工藝簡單、無有害殘留等特點，因此這種方法提取活性成分潛力巨大[9]。

1 材料與方法

1.1 材料。魚腥草(購于北京同仁堂衡水分店)經清洗后烘干，粉碎機粉碎后過80 目篩；蘆丁標準品(購于國家標準物質網)；植物提取海藻肥纖維素酶(活力單位10000U/g，南寧東恒華道生物科技有限責任公司)；果膠酶(活力單位100000U/g，江蘇東聚生物科技有限公司)。

1.2 儀器設備。破壁機(深圳市凈品環?？萍加邢薰?；電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；分光光度計(722G 可見分光光度計，廣州廣一科學儀器有限公司)。

1.3 黃酮測定方法。黃酮測定法參考李志清《發酵法對比提取丹參黃酮研究》[10]。

2 結果與分析

2.1 復合酶配比對魚腥草黃酮提取影響研究。魚腥草黃酮提取過程中，復合酶添加量按2 g/L 添加，纖維素酶和果膠酶分別按10∶0、9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7 的比例進行添加，魚腥草料液比例3∶7，提取溫度自然，提取時間4 h，研究不同酶配比對魚腥草黃酮提取的影響，結果如圖1 所示。纖維素酶和果膠酶對植物細胞壁的分解破壞途徑不同，但并不是越多越好，需要考慮二者之間的恰當比例，只有二者添加比例合適，才能更有效地發揮作用。由圖1 可知，當開始只添加纖維素酶時，提取效果不是很好，隨著果膠酶的添加，提取量開始增大，當纖維素酶和果膠酶添加比例為7∶3 時，魚腥草黃酮的提取量最大，之后隨著果膠酶添加量的增加，魚腥草黃酮提取量呈下降趨勢，說明纖維素酶和果膠酶添加比例以7∶3 較為適宜。

圖1 復合酶配比對魚腥草黃酮提取影響

2.2 復合酶添加量對魚腥草黃酮提取的影響。在研究纖維素酶復合果膠酶配比對魚腥草黃酮提取量影響的基礎上，研究復合酶添加量對魚腥草黃酮提取量的影響，復合酶添加量分別設定為1 g/L、1.5 g/L、2 g/L、2.5g/L、3g/L、3.5g/L、4g/L，溫度自然，提取時間4 h，纖維素酶和果膠酶添加比例設定為7∶3，提取結束后測定魚腥草黃酮提取量，結果如圖2 所示。一定量的復合酶才能更好地發揮分離提取的效果，復合酶添加量低，影響提取效率，復合酶添加量高，增加提取成本。由圖2 可知，隨著復合酶添加量的增加，魚腥草黃酮提取量增大，添加量為3g/L時，魚腥草黃酮提取量達到最高，之后隨復合酶添加量的增加，魚腥草黃酮提取量變化不明顯，因此，確定復合酶添加量為3g/L。

圖2 復合酶添加量對魚腥草黃酮提取影響

2.3 酶解溫度對魚腥草黃酮提取的影響。在一定范圍內，酶活力和溫度呈現一定的相關性，高溫能激發酶的活性，溫度太高，酶的活性會鈍化，每種酶都有自己適宜的活力溫度范圍，酶解提取魚腥草黃酮過程中，復合酶比例為7∶3，復合酶添加量3 g/L，酶解時間4 h，分別設定不同酶解溫度進行提取，結果如圖3 所示。由圖3 可知，復合酶分解提取魚腥草黃酮，提取量和酶解溫度很相關，隨著酶解溫度的升高，魚腥草黃酮提取量迅速增加，且增加幅度很大，當提取溫度為50 ℃時，魚腥草黃酮提取量最高，之后，隨溫度升高，迅速降低，表明酶活性鈍化。

圖3 酶解溫度對魚腥草黃酮的提取影響

2.4 酶解時間對魚腥草黃酮提取的影響。研究不同酶解時間對魚腥草黃酮提取的影響，復合酶比例為7∶3，復合酶添加量3 g/L，酶解溫度50 ℃，分別在酶解2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、14 h 時測定黃酮提取量，結果如圖4 所示。由圖4 可知，酶解時間對酶解效果有一定的影響，開始隨著酶解時間的延長，魚腥草黃酮提取量增大，當提取時間為8 h 時，魚腥草黃酮提取量最高，達到16.18 mg/g，之后隨酶解時間的延長，魚腥草黃酮提取量出現平穩降低的趨勢，因此確定酶解時間以8 h 較為適宜。

圖4 酶解時間對魚腥草黃酮提取的影響

3 結論與討論

復合酶法提取魚腥草黃酮研究中，對復合酶比例、復合酶添加量、酶解溫度、酶解時間等工藝條件進行了優化，確定了復合酶法提取魚腥草黃酮的提取工藝為：復合酶比例7∶3，復合酶添加量3 g/L，酶解溫度50 ℃，酶解時間8 h，此工藝條件下，魚腥草黃酮提取量達到16.18 mg/g，工藝條件優化后極大地提高了魚腥草黃酮的提取量，為之后的工業化酶解提取魚腥草黃酮提供了技術支持。